[发明专利]一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法

权利要求书

1.一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)乌鳢前处理：收集乌鳢表皮的黏液，备用；

(2)热处理：将步骤(1)收集得到的乌鳢表皮的黏液进行水浴加热，得到热处理的黏液；

(3)离心：将步骤(2)中热处理的黏液冷却至一定温度后，离心收集上清液；

(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液进行预冷冻后，再采用真空冷冻干燥机进行干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液的冻干粉，即为粗提物；

(5)采用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中的冻干粉进行纯化，然后用蒸馏水洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经冻干处理，得到冻干的组分；

(6)采用阳离子交换柱对步骤(5)中得到冻干的组分进一步纯化，使用磷酸盐缓冲液线性洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到的产物即为乌鳢表皮黏液抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述收集乌鳢表皮的黏液的具体操作为：将新鲜乌鳢受伤处理后、洗净，置于水中，每隔1-2小时用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背收集黏液；未收集乌鳢腹侧皮肤的粘液，以避免肠和精子污染。

3.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述水浴的温度为50～80℃，时间为5～10min。

4.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷却至一定温度为5℃以下；所述离心的条件为：离心转速为6000～8000r/min，离心时间为20～40min。

5.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述预冷冻的温度为-40℃，时间为5～7h。

6.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述纯化时上样的样品为冻干粉与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL；所述纯化的柱规格为1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为2-5mL。

7.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述纯化时上样的样品为冻干的组分与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL。

8.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述纯化的柱规格为1.2cm×50cm，流速为0.8-1.5mL/min；所述磷酸盐缓冲液线性洗脱时的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为40-50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.0–6.5；所述洗脱液B是在洗脱液A中加入NaCl，NaCl的终浓度为0.5-1.0M。

9.根据权利要求1-8任一所述方法制备的乌鳢表皮黏液抗菌肽用于制备免疫制剂或饲料添加剂的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述乌鳢表皮黏液抗菌肽制备的免疫制剂或饲料添加剂能够抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长活性。