[发明专利]一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法

说明书

本发明属于生物提取技术领域，涉及一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。制备步骤如下：收集乌鳢背部表皮的黏液，进行水浴加热，然后经冷却、离心收集上清液；预冷冻后，冻干得到乌鳢表皮黏液的冻干粉；采用Sephadex G‑100凝胶柱对冻干粉进行纯化，然后收集产物在280nm下检测吸光值，收集组分，经冻干得到冻干的组分；再采用阳离子交换柱进一步纯化，收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到乌鳢表皮黏液抗菌肽；本发明工艺简单且成本较低，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑制效果，具有广谱抑菌性，可用于制备鱼类防腐剂或饲料添加剂，有助于实现乌鳢加工副产物高值化利用。

技术领域

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是广泛分布于哺乳动物，两栖动物，昆虫或其他无脊椎动物中的一类具有抗菌活性的多肽类物质，也称为宿主防御肽，是先天免疫系统的重要组成部分。AMP通常在10至50个氨基酸之间，净正电荷为2至8，对多种微生物包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，真菌，病毒和寄生虫表现出广泛的活性，且毒性很小或没有毒性。抗菌肽具有热稳定性、广谱抑菌及不易产生耐药性等优点，研究发现其具有代替传统抗生素的潜力。

鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或受到病原侵袭时，能迅速产生抗菌肽杀伤病原微生物防御入侵。鱼的天然免疫力与唾液、黏液、循环系统和其他易受病原体影响的系统中抗微生物肽(AMPs)的分泌有关。皮肤粘液为鱼类提供了抵抗水生微生物的第一道防线，除了充当鱼类与其水生环境之间的物理屏障之外，皮肤粘液还具有通过一系列先天免疫因子(如溶菌酶，凝集素，蛋白水解酶，黄素酶，免疫球蛋白和C反应蛋白)介导的抗菌活性，因此，从鱼类皮肤粘液中提取抗菌肽是获得抗菌肽的有效途径。

关于抗菌肽提取制备方法主要有直接浸提法、酶解制备法、化学合成法和工程菌表达法。化学合成法目前为抗菌肽生产中较为常见的方法，但人工合成抗菌肽成本较高，使其难以批量用于生活、养殖等低成本生产中。乌鳢俗称黑鱼，是一种经济价值和营养医学价值较高的淡水名贵鱼类，随着乌鳢养殖业的发展，在乌鳢加工过程中产生大量黏液未被有效利用，既浪费了生物资源，也对生态环境产生了巨大压力；因此，寻找简单高效的提取方法，从乌鳢表皮黏液中提取抗菌物质是亟需解决的技术问题，这有助于提高乌鳢的副产物加工和综合利用、实现废弃物料高值化利用、减少环境污染、促进乌鳢的可持续发展。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题与不足，本发明的首要目的在于提供一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。创建了无酸碱预处理的乌鳢黏液抗菌物质提取技术，以期得到一种绿色清洁的黏液抗菌物质提取方法。

本发明的目的通过以下方案实现：

一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)乌鳢前处理：收集乌鳢表皮的黏液，备用；

(2)热处理：将步骤(1)收集得到的乌鳢表皮的黏液进行水浴加热，得到热处理的黏液；

(3)离心：将步骤(2)中热处理的黏液冷却至一定温度后，离心收集上清液；

(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液进行预冷冻后，再采用真空冷冻干燥机进行干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液的冻干粉，即为粗提物；

(5)采用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中的冻干粉进行纯化，然后用蒸馏水洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经冻干处理，得到冻干的组分；

(6)采用阳离子交换柱对步骤(5)中得到冻干的组分进一步纯化，使用磷酸盐缓冲液线性洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到的产物即为乌鳢表皮黏液抗菌肽。