[发明专利]一种检测猪盖他病毒试剂盒及其检测方法在审
申请号: | 202110121216.3 | 申请日: | 2021-01-28 |
公开(公告)号: | CN112662820A | 公开(公告)日: | 2021-04-16 |
发明(设计)人: | 刘金玲;孙代鹏;陶大鹏;魏澍;杜方圆;王雨彤 | 申请(专利权)人: | 沈阳农业大学 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11 |
代理公司: | 济南佰智蔚然知识产权代理事务所(普通合伙) 37285 | 代理人: | 赵允洲 |
地址: | 110161 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 病毒 试剂盒 及其 方法 | ||
本发明属于生物医学专业领域,具体涉及一种猪盖他病毒的检测试剂盒及其检测方法。该诊断试剂盒包括两对巢式PCR引物,所述第一对引物为5’‑ATGGCGGACGTGTGACATCAC‑3’和5’‑GTAACCTTCGCATGACACCACC‑3’;第二对引物为5’‑GCTACTCCACATAGTGAGAG‑3’和5’‑AACATGAATGGAGTGGTATC‑3’。该试剂盒可对猪盖他病毒(GETV)进行早期检测,是一种快速、简便、特异、灵敏的检测GETV的方法,具有非常好的应用前景。
技术领域
本发明属于生物医学专业领域,具体涉及一种检测猪盖他病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪盖他病毒(Getah virus,GETV)现在已经成为影响规模化养猪业的重要虫媒源病毒。该病毒可引起母猪(尤其妊娠前期)产死胎、出生仔猪震颤、皮肤发红、精神颓废、棕黄色腹泻及较高的死亡率。当断奶仔猪受到应激反应时易引发GETV感染,常常与一些细菌或病毒发生混合感染,严重时死亡率可达50%以上。患病猪、带病猪以及虫媒源是本病的重要传染源。鉴于近些年来盖他病毒对畜牧业的严重危害,有必要建立一种快速、灵敏、准确的检测方法对其监控,以确保畜牧业的健康发展。
目前尚未有效的手段对盖他病毒(GETV)进行快速、准确的检测,因此针对该病毒研制一种快速检测试剂盒,成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对猪盖他病毒检测试剂盒及其检测方法。本发明人经前期研究,设计一种巢式PCR检测试剂盒,可作为一种快速、简便、特异的GETV感染诊断方法。该试剂盒具有简便、快捷、特异性高、低成本等特点,为盖他病毒检测及流行病学调查提供了一项重要的技术手段。
本发明提供采用如下技术方案:
一种检测猪盖他病毒NSP1基因的试剂盒,包括两对巢式PCR引物,所述第一对引物为5’-ATGGCGGACGTGTGACATCAC-3’和5’-GTAACCTTCGCATGACACCACC-3’;第二对引物为5’-GCTACTCCACATAGTGAGAG-3’和5’-AACATGAATGGAGTGGTATC-3’。
该试剂盒检测的是猪盖他病毒的NSP1基因。
进一步的,该试剂盒中其他组成,可按本领域常规进行选择,例如还可包括ProbeqPCR MIX,也可使用PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶代替。
上述试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
1)提取样品基因的DNA或反转录得到cDNA,构建样品GETV-NSP1-pBM16克隆质粒;
2)以GETV-NSP1-pBM16克隆质粒为模板,使用第一对引物进行第一轮PCR扩增;
3)第一轮PCR扩增结束后,取PCR产物为模板,使用第二对引物进行第二轮PCR扩增,后进行凝胶电泳;
4)如电泳中出现326bp的条带时,证明为阳性。
进一步的,所述步骤2)的PCR反应条件如下:预变性95℃5min;95℃50s、50℃30s、72℃1min,30个循环,最后72℃延伸10min。
所述3)中PCR反应条件如下:预变性95℃5min;95℃50s、52℃30s、72℃1min,30个循环,最后72℃延伸10min。
该方法的最低核酸检出量为8copies/μL。
本发明根据盖他病毒非结构蛋白NSP1设计特异性的巢氏PCR引物。由于所选取的基因序列高度保守,因此作为鉴定盖他病毒的重要依据。使用本发明建立的巢氏PCR试剂盒最低能检测8拷贝数的病毒粒子,具有较高的灵敏性。
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