[发明专利]一种荧光纳米探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种荧光纳米探针，其特征在于：所述探针为RGD-HBc/ICG，其包括乙肝病毒样蛋白笼HBc VLP，其表面融合RGD肽，所述HBc VLP内装载吲哚菁绿ICG。

2.一种权利要求1所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、以HBc-160蛋白氨基酸序列为基础，将RGD序列插入到HBc-160蛋白序列的第78和81位氨基酸之间，并将两个富含甘氨酸的多肽GTSGSSGSGSGGSGSGGGG作为连接肽插入到RGD两端并获得RGD-HBc蛋白；

S2、将连有目的基因的质粒转化到大肠杆菌中；

S3、挑取步骤S3所得的单菌落在LB培养基中进行扩大培养，直到其在600nm波长处的吸光值达到0.6-0.8后，用0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养得到菌液；

S4、将菌液离心收集细菌后，裂解菌体，再次通过离心除去细胞碎片后收集上清液；

S5、在上清液中加入饱和硫酸铵，将蛋白沉淀并离心收集沉淀；

S6、将沉淀用10mM三羟甲基氨基甲烷溶液吹起成混悬液，装入透析袋，进行透析除盐得到蛋白粗提物；

S7、将蛋白粗提物进行DEAE离子交换层析分离，收集流出液，装进透析袋中用聚乙二醇-20000浓缩到之前1/2体积，然后过分子筛层析柱收集得到纯化的RGD-HBc蛋白；

S8、纯化后的RGD-HBc蛋白加入解聚缓冲液解聚，加入4倍质量比的ICG粉末进行搅拌；

S9、将步骤S8搅拌的混合物置于4000M的透析袋，先于第一复聚缓冲液中悬浮搅拌，后转移至第二复聚缓冲液悬浮搅拌，RGD-HBc蛋白单体复聚并去除多余游离ICG，得到探针RGD-HBc/ICG。

3.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述质粒转化到大肠杆菌中具体步骤包括：

S21、在100μL的感受态大肠杆菌细胞悬液中加入1ng的pET43.1(a)-RGD-HBc质粒，放置于42℃水浴60-90s；

S22、将步骤21所得产物转移至冰上冷却2-3min至转化结束；

S23、将转化结束后的产物加入到LB培养基中于37℃下进行培养。

4.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养条件为18℃，时间为18h。

5.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤S4具体为：将菌液以5000rpm/min的转速离心收集细菌，通过超声裂解法裂解菌体，通过12000rpm/min的转速离心30min后除去细胞碎片后收集上清液。

6.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S5中所述蛋白沉淀离心的条件为12000rpm/min，时间为30min。

7.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S8中所述解聚缓冲液包括8M尿素、450mM氯化钠、3％甘氨酸及150mM三羟甲基氨基甲烷，解聚条件为4℃，时间为15min。

8.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S9中所述第一复聚缓冲液包括200ml的丙三醇，100ml的1M三羟甲基氨基甲烷、1700ml的超纯水、20g的甘氨酸及18g的氯化钠，复聚条件为4℃，时间为4h。

9.如权利要求2所述的一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤S9中所述第二复聚缓冲液包括100ml的1M三羟甲基氨基甲烷、1900ml的超纯水、20g的甘氨酸及18g的氯化钠，复聚时间为12h。

10.如权利要求1所述的荧光纳米探针可应用于引导肿瘤手术切缘的荧光导航探针。