[发明专利]一种荧光纳米探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种荧光纳米探针及其制备方法和应用，所述探针为RGD‑HBc/ICG，其包括乙肝病毒样蛋白笼HBc VLP，表面融合有RGD肽，内部装载吲哚菁绿ICG。本发明提供一种荧光纳米探针及其制备方法和应用，用于区分乳腺肿瘤与正常组织，精确识别肿瘤边界，对可视化肿瘤的手术切缘具有显著效果，降低手术切缘阳性率，提高患者的生活质量并延长总生存期，对改善患者预后具有重要临床意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荧光纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

外科手术是实体肿瘤的主要治疗方式之一，其中保证肿瘤完整切除是手术成功关键。多个研究表明手术切缘阴性可显著提高患者的生存时间及减少后续辅助治疗的需求，如在恶性脑胶质瘤中，尽可能的切除肿瘤可以显著延长患者的无病生存期，在乳腺癌的保乳手术治疗中，切缘状态是影响患者的二次手术率及局部复发率主要危险因素之一。由此可见，阳性手术切缘严重影响患者预后并显著增加医疗支出，但经近几十年的医学发展，这种状况仍无明显改观，切缘阳性率仍高达15％-60％。因此，如何在术中精准识别肿瘤边界是目前临床上面临的巨大挑战。

近年来，近红外荧光成像技术在术中肿瘤边界精准识别方面，荧光分子影像具有独特的优势。荧光探针是在体荧光成像的关键组成部分，其中靶向性分子探针又最具特色，其可以通过特定的靶向肿瘤的载体将荧光基团主动运输至肿瘤部位，用于区分肿瘤与正常组织。

目前的靶向性肿瘤的探针多为抗体类荧光分子探针、小分子多肽类探针及无机纳米颗粒探针，其中抗体类荧光分子探针，其洗脱时间长，多需在术前3-4天注射，且制备价格相对昂贵；小分子多肽类探针在体内环境不够稳定，在体代谢很快，导致发光时间很短；无机纳米颗粒存在容易在肝肾聚集，不易降解代谢的特点，而且需要人工进行靶向性修饰。

发明内容

本发明一种荧光纳米探针及其制备方法和应用，用于区分乳腺肿瘤与正常组织，精确识别肿瘤边界，对可视化肿瘤的手术切缘具有显著效果，降低手术切缘阳性率，提高患者的生活质量并延长总生存期，对改善患者预后具有重要临床意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

所述探针为RGD-HBc/ICG，其包括乙肝病毒样蛋白笼HBc VLP，表面融合RGD肽，内部装载吲哚菁绿ICG。

一种荧光纳米探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

S1、以HBc-160蛋白氨基酸序列为基础，将RGD序列插入到HBc-160蛋白序列的第78和81位氨基酸之间，并将两个富含甘氨酸的多肽GTSGSSGSGSGGSGSGGGG作为连接肽插入到RGD两端并获得RGD-HBc蛋白；

S2、将连有目的基因的质粒转化到大肠杆菌中；

S3、挑取步骤S3所得的单菌落在LB培养基中进行扩大培养，直到其在600nm波长处的吸光值达到0.6-0.8后，用0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养得到菌液；

S4、将菌液离心收集细菌后，裂解菌体，再次通过离心除去细胞碎片后收集上清液；

S5、在上清液中加入饱和硫酸铵，将蛋白沉淀并离心收集沉淀；

S6、将沉淀用10mM三羟甲基氨基甲烷溶液吹起成混悬液，装入透析袋，进行透析除盐得到蛋白粗提物；

S7、将蛋白粗提物进行DEAE离子交换层析分离，收集流出液，装进透析袋中用聚乙二醇-20000浓缩到之前1/2体积，然后过分子筛层析柱收集得到纯化的RGD-HBc蛋白；

S8、纯化后的RGD-HBc蛋白加入解聚缓冲液解聚，加入4倍质量比的ICG粉末进行搅拌；