[发明专利]一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用

说明书

本发明提出了一种新鲜组织样本的保存液，所述保存液由EDTA、Tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述EDTA的最终浓度为50～100mg/L，Tris的最终浓度为2.01～4.04g/L，草酸铵的最终浓度为120～200mg/L，柠檬酸钠的最终浓度为1.8～2.4g/L，甘油的最终浓度为300‑400g/L，胎牛血清的最终浓度为130‑180g/L，余量为DEPC水。本发明保存液是一种液态的、无毒的组织保存试剂，并且配制简单、使用方便、不需特殊设备；样本无须冷藏运输，加入保存液4℃保存即可；并可有效避免RNA降解，同时维持组织活性，避免人源宿主核酸的污染。

技术领域

本发明涉及生物医学-病原微生物宏基因组测序领域，尤其涉及一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用。

背景技术

近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下。病原学诊断是感染性疾病诊断中最重要的一环，对于提升中重症感染性疾病的诊疗质量至关重要。目前病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。随着基因组学技术的发展，核酸检测成为病原学诊断中的一个重要方向，其中宏基因组二代测序技术(mNGS)越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面。

mNGS过程主要包括样本处理(包含保存、运输)、核酸提取、文库构建、上机测序及数据比对与判读。对于这些影响检验结果的关键过程，都需要有相应的质控点，包括样本保存是否合理、运输过程保持低温状态、核酸提取质量、文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及数据分析可靠性等。只要不符合其中的一个质控点，都有可能无法得出准确的检测报告，找不到真正的致病菌。

目前新鲜组织样本进行病原体检测，其保存方法是将样品置于生理盐水中，最好在24h内送检；并且在运输过程中，使其温度保持在4℃条件下。生理盐水保存组织存在一定的问题：第一组织脱离生物体后RNA易降解，对运输和保存的要求较高。在实践中，有时候运输距离较远，时间超过了24h，用常规的生理盐水方法保存和运输样品，使得样品中的核酸酶导致其中的病原体核酸容易降解，进而影响核酸提取质量及检测结果；第二临床样本中微生物的核酸含量远低于人核酸含量，通常不足人源核酸含量的5％。因此还需要进行适当的人源核酸去除来确保检测的敏感度。但生理盐水只能保持组织原有状态，不能长久维持其活性。宿主的细胞活率下降，会释放一定的人源核酸，进而会造成人源宿主核酸的污染，影响检测结果。

因此，开发一种新鲜组织样本(用于病原体检测)保存液，使其免受RNA酶降解，并减少人源宿主核酸的污染，是优化新鲜组织样本采集这一步骤的关键，也是为后续提供高质量核酸的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用，使新鲜组织样本免受RNA酶降解，并减少人源宿主核酸的污染。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种新鲜组织样本的保存液，所述保存液由EDTA、Tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述EDTA的最终浓度为50～100mg/L，Tris的最终浓度为2.01～4.04g/L，草酸铵的最终浓度为120～200mg/L，柠檬酸钠的最终浓度为1.8～2.4g/L，甘油的最终浓度为300-400g/L，胎牛血清的最终浓度为130-180g/L，余量为DEPC水。

进一步地，所述保存液由EDTA、Tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述EDTA的最终浓度为65mg/L，Tris的最终浓度为3.55g/L，草酸铵的最终浓度为160mg/L，柠檬酸钠的最终浓度为2.2g/L，甘油的最终浓度为350g/L，胎牛血清的最终浓度为175g/L，余量为DEPC水。

进一步地，所述保存液的pH值为7.0～9.0，优选7.5～8.5。