[发明专利]一种大规模制备传代鸡胚细胞生产病毒的方法有效

专利信息
申请号: 202110126787.6 申请日: 2021-01-29
公开(公告)号: CN113373107B 公开(公告)日: 2022-12-30
发明(设计)人: 朱为;张林亚;周旭 申请(专利权)人: 上海生物制品研究所有限责任公司
主分类号: C12N5/073 分类号: C12N5/073;C12N5/071;C12N7/00;C12N7/02;A61K39/165;A61K39/205;A61P31/14
代理公司: 上海一平知识产权代理有限公司 31266 代理人: 徐迅;马莉华
地址: 200052 上*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 大规模 制备 传代 细胞 生产 病毒 方法
【说明书】:

发明提供了一种大规模制备传代鸡胚细胞生产病毒的方法。具体地,本发明提供了一种在无二氧化碳或低二氧化碳条件下,连续传代培养鸡胚细胞生产病毒类产品的方法。本发明的方法简单高效,可以在无二氧化碳或低二氧化碳下实现原代鸡胚细胞的连续传代,尤其适用于在多层细胞工厂中大规模制备传代鸡胚细胞,进而实现病毒类产品的规模化生产。

技术领域

本发明涉及病毒类疫苗和制剂领域,尤其涉及利用传代鸡胚细胞生产病毒性疫苗和治疗性病毒制剂的生产方法。

背景技术

疫苗是预防与控制传染性疾病的有效手段,已有多种病毒性疫苗研制成功,如麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗等。病毒性疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。近年来,利用病毒进行基因治疗和肿瘤治疗(如溶瘤病毒)也取得进展。病毒是专性细胞内生物,必须在细胞内进行复制和包装。病毒的生产离不开细胞基质,主要包括3类,人二倍体细胞株、原代细胞和连续传代细胞系。

原代细胞直接来源于动物组织或胚胎,包括地鼠肾、猴肾、兔肾、牛肾、鸡胚、鹌鹑胚等。原代细胞来源容易,属正常细胞,无致瘤性,用于疫苗生产已超过40年。原代细胞经原始培养或传代少数几代内(一般不超过5代)的细胞被允许用于病毒类产品的生产。例如,目前国内疫苗生产多采用原始培养的细胞。

然而,传统的麻疹疫苗或腮腺炎疫苗等采用原代鸡胚细胞通过单层细胞培养瓶或多层细胞工厂生产,需要处理大量的鸡胚。这一方法限制了单批可操作的数量,人工劳动强度大,污染风险高,而且来自不同个体和批次的鸡胚细胞质量和敏感性也存在差异。虽然将原代鸡胚细胞直接接种到细胞工厂,可以在一定程度上解决转瓶和单层细胞培养瓶劳动强度大、污染风险高的问题,但仍需要处理大量的鸡胚,无法解决前期细胞制备过程繁琐费时、污染风险高的问题,也无法解决细胞均一性差和批间差异大的问题。

此外,细胞扩增常用的培养介质包括转瓶、单层细胞培养瓶和多层细胞工厂。细胞培养和接种病毒后,需要充分的营养物质、适当的pH和良好的气体供应,才能维持细胞的生长和病毒的增殖。细胞通常在2%~10%二氧化碳浓度的培养箱中培养才能优良生长。在大规模生产时,为多层细胞工厂提供二氧化碳培养条件,不但增加成本,还存在高压二氧化碳钢瓶的安全性风险和断气风险。在非强制通气条件下,多层细胞工厂的气体交换不佳,需要专门的培养装置保证二氧化碳供应,进一步增加生产成本。因此,无需二氧化碳的培养条件,是最为简单易行的培养方式,适宜于大规模生产。

综上所述,本领域迫切需要开发一种适合工业化生产、污染风险低、简单高效的原代鸡胚细胞传代培养生产病毒类产品的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种适合工业化生产、污染风险低、简单高效的原代鸡胚细胞传代培养生产病毒类产品(如病毒疫苗、治疗类病毒产品,包括重组病毒)的方法。

本发明的传代培养原代鸡胚细胞提供了一种高效的病毒性疫苗规模化的生产平台。

本发明提供了一种在无二氧化碳或低二氧化碳条件下传代培养原代鸡胚细胞的培养液。

在本发明的第一方面,提供了一种动物细胞传代培养的方法,所述方法包括步骤:

(S1)提供一原代动物细胞P0;

(S2)将所述的原代动物细胞P0,在浓度C0的二氧化碳条件下,在细胞培养液中进行传代培养,从而获得第n代的传代细胞Pn,其中n为传代次数;

其中,所述培养液包含基础培养液和强化添加物,所述强化添加物包括:

(1)亚油酸或其盐;较佳地亚油酸钠;

(2)硒元素;较佳地,亚硒酸或亚硒酸盐;更佳地,亚硒酸钠;

(3)钒元素,较佳地,偏钒酸铵;和

(4)硫辛酸。

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