[发明专利]斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型、其构建方法及评价方法

说明书

本案涉及一种斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型、其构建方法及评价方法，构建方法包括挑选发育正常的斑马鱼通过浸入细菌液的手段获得斑马鱼炎克雷伯菌感染模型，评价方法包括采用苏丹黑B和中性红染色观察炎症细胞的变化情况。本发明采用细菌浸入实验代替传统斑马鱼模型中的显微注射细菌液的感染方法，细菌浸入实验中斑马鱼的感染率高达90％；独创性的设计了对斑马鱼进行染色的方法，染色后可以显微镜下直观的观察到嗜中性粒细胞和巨噬细胞的变化，方便直观的对肺炎毒力做出评估；建立了完整的评价方法，可以充分评估肺炎克雷伯菌毒力和致病性。

技术领域

本发明属于生物技术模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型、其构建方法及评价方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，可侵害任何动物的肠道和呼吸道等器官，从而引起肺部感染、肝脓肿、败血症、脑膜炎、坏死性筋膜炎，严重时甚至导致死亡。肺炎的毒性有很多原因，主要是因为其表面胶囊、脂质多糖、皮利和铁运输系统。这些细菌的一些表型是不同抗原特性的基础，也是细菌对人体机理有害的原因。编码这些外部毒性表型的基因被称为毒力基因。

目前，有许多生物模型可以评估肺炎克雷伯菌的毒性，包括小鼠、大鼠、猪、盘基网柄菌和蜡螟，前三个价格昂贵，不适合高通量实验，后两种是无脊椎动物，实验数据参考量不是很大。斑马鱼是一种小型热带观赏鱼。斑马鱼具有产卵能力大、体外发育、胚胎透明等优点，已成为生物医学研究中继老鼠之后的第三大模型生物，由此，斑马鱼可以作为宿主来评估研究肺炎克雷伯菌的毒力和病理学机制。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明利用细菌浸入的手段获得了斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型并通过苏丹黑B和中性红染色来评价其炎症细胞感染效果。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型的构建方法，包括：挑选发育正常的斑马鱼通过浸入细菌液的手段获得斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型。

进一步地，所述斑马鱼为受精3天后的斑马鱼幼鱼。

进一步地，所述细菌液的制备方法如下：将肺炎克雷伯菌细菌培养物生长到指数相OD600＝0.4±0.6，离心、洗涤，随后分散于灭菌的E3培养液中，得到细菌液。

进一步地，所述浸入细菌液的手段具体为将斑马鱼浸入细菌液中，28.5℃下恒温孵育72h。

本发明提供一种如上所述的构建方法构建出的斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型。

本发明进一步提供一种使用如上所述的斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型对肺炎炎症细胞的评价方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

1)对斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型进行巨噬细胞和中性粒细胞染色；

2)于显微镜下观察中性粒细胞和巨噬细胞的变化，以此获得对肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型后炎症细胞的评价结果；

其中，步骤1)中的巨噬细胞染色方法为：将斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型浸于4％甲醛溶液中，用PBST缓冲液冲洗，随后用苏丹黑B染色，观察巨噬细胞；

中性粒细胞染色方法为：将斑马鱼肺炎克雷伯菌感染模型浸于4％甲醛溶液中，用PBST缓冲液冲洗，之后用70％乙醇洗涤，置于2.5mg/L的中性红染料溶液中培养，观察中性粒细胞。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明对斑马鱼幼鱼的感染途径做出了改进，大大提高了感染效率，省时省力；独创性的设计了对斑马鱼的染色方法，可以直观的观察炎症细胞的变化情况；