[发明专利]基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于，反应体系包括：

多对与靶序列匹配的扩增引物及对应相同所述靶序列的多个双标记寡核苷酸探针；引物对中，至少包括具有浓度差的第一引物对，所述第一引物对包含一高浓度引物和一低浓度引物，所述第一引物对对应相同所述靶序列的双标记寡核苷酸探针的浓度至少超过所述第一引物对中低浓度引物的添加量；

所述反应体系还包括一个热稳定且具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶；

所述反应体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸探针的熔解温度Tm值大于与之匹配的两个所述引物的熔解温度Tm，对应相同靶序列的双标记寡核苷酸探针的实时扩增荧光信号能被正常检测；

在标记的寡核苷酸探针与扩增的靶核酸单链杂交形成的熔解曲线分析中，产生一个标记的寡核苷酸探针Tm值相关的特征峰。

2.根据权利要求1所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于，反应体系还包括逆转录酶。

3.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：标记了相同荧光基团的多个所述双标记荧光探针的熔解温度Tm值彼此相差不小于2℃。

4.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述低浓度引物与所述高浓度引物的浓度比例为1:3-1:30。

5.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述低浓度引物与所述高浓度引物的浓度比例为1:4-1:10。

6.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述第一引物对对应相同靶序列的双标记寡核苷酸探针的浓度至少超过所述低浓度引物的添加量的10%。

7.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述第一引物对对应相同靶序列的双标记寡核苷酸探针的浓度至少超过所述低浓度引物的添加量的30%。

8.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述第一引物对对应相同靶序列的双标记寡核苷酸探针的浓度至少超过所述低浓度引物的添加量的100%。

9.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述反应体系中中至少还包括一浓度差不超过50%的第二引物对。

10.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：所述反应体系中所述双标记寡核苷酸探针包括TaqMan型或分子信标型探针。

11.根据权利要求1或2所述的多重检测靶核苷酸序列的方法，其特征在于：对待检样品经扩增和熔解曲线分析，待检样品中某靶标阳性的标准是有扩增峰、有熔解温度对应某靶标熔解温度的特征峰。

12.一种基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

一个热稳定且具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶；

多对与靶序列匹配的扩增引物及对应相同所述靶序列的多个双标记寡核苷酸探针，至少有一个双标记寡核苷酸探针的熔解温度Tm值大于与之匹配的两条所述引物的熔解温度Tm；双标记寡核苷酸探针的种类大于相应标记所述双标记寡核苷酸探针的所用的荧光通道数量；所述试剂盒的引物对中，至少包括具有浓度差的第一引物对，所述第一引物对包含一高浓度引物和一低浓度引物；所述第一引物对对应相同所述靶序列的双标记寡核苷酸探针的浓度至少超过所述第一引物对中低浓度引物的添加量；

以及如何进行多重检测靶核苷酸的说明书和/或用于RT-PCR的逆转录酶。

13.根据权利要求12所述的多重检测靶核苷酸的试剂盒，其特征在于：标记了相同荧光基团的多个所述双标记荧光探针的熔解温度Tm值彼此相差不小于2℃。