[发明专利]基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其试剂盒

说明书

本申请涉及一种基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其应用的试剂盒，本发明采用双标记寡核苷酸探针对多重PCR扩增产物进行熔解曲线分析，特别是在单个荧光检测通道，通过具备相同荧光基团的至少一个双标记寡核苷酸探针(通常是两个或两个以上)和与之匹配的单链核酸产物的杂交双链的熔解曲线来进行检测；本发明能够实现一个荧光通道进行多重检测且每个被检靶位点的检测使用单一探针的效果，特别适用于利用单个荧光通道用于检测多个靶标，同时本发明有效结合了扩增曲线和溶解曲线的双重判读，更能够保证检测的特异性。

技术领域

本申请涉及生物化学技术领域，特别涉及一种基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其试剂盒。

背景技术

多重核酸检测主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定，目前最成熟的还是PCR核酸扩增技术，在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。最早的技术是在电泳PCR中进行多重扩增检测，通过电泳后的多个条带来鉴定多个扩增产物。在实时荧光PCR技术出现后，在多荧光通道的仪器上，通过在每个荧光通道中配置一个对应荧光波长的核酸探针，就能实现多重扩增，但该技术受仪器的荧光通道数量限制。

用于扩增产物的熔解曲线分析最初是荧光染料法实时PCR。在扩增反应完成后，在荧光监测下对反应产物逐渐加温(从低于引物熔解温度到超过90℃或更高)，用染料荧光信号改变的负的一次导数对温度作图，双链DNA产物会在其熔解温度Tm有对应的特征峰。理论上在一个荧光通道内染料熔解曲线可以有多个特征峰，但无法用不同的荧光染料区分Tm相邻近的目标，即无法使用不同的荧光染料针对双链不同，每个荧光通道都显示所有双链Tm对应的特征峰，无法在多个荧光通道内得到比在一个荧光通道内得到的更多的特征峰结果。

目前已经在采用核酸探针来产生熔解曲线进行(不对称)扩增(单链)产物的判别，尤其是在不同的荧光通道中，同时设置多个核酸探针得到不同熔解曲线特征峰来代表不同的靶序列。在扩增曲线和熔解曲线中都使用荧光探针。专利CN201010166995.0公开了荧光探针法多重PCR熔解曲线特征峰检测，它要求采用的DNA聚合酶无核酸外切酶活性，扩增曲线的荧光信号与熔解曲线一样，都来自探针与靶序列的杂交。其要求扩增过程中，荧光探针不被降解，相应的，与因荧光探针降解而荧光基团与淬灭基团远离产生的荧光信号相比，荧光探针不降解的荧光信号较弱。专利CN201410206857.9使用具有核酸降解酶活性的DNA聚合酶，使用两种探针，高Tm的扩增阶段的荧光探针和低Tm的做熔解曲线分析的探针，前者在扩增阶段被降解。以两种荧光探针达到扩增曲线和熔解曲线的信号都比较好的技术效果。虽然这种方案的成本比较高，但是扩增曲线的作用至少有两个：(1)先完成扩增曲线，可以较早得到信息；(2)扩增曲线也是由引物和探针共同参与形成的，同样具有特异性，只是多组引物探针存在时，每一组都可以产生扩增信号，因而还需要熔解曲线的信息；特别的，扩增曲线结果阴性，熔解曲线阳性的情况是不正常的，应判为可疑，重新检测。

然而，现有技术中并没有能够结合扩增曲线和溶解曲线信息，并且低成本高特异性地实践应用的检测数量多于荧光通道数的多重荧光核酸扩增检测方法，尤其是在单个荧光检测通道的应用上。

发明内容