[发明专利]DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法

权利要求书

1.一种DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备体系包括由滚环扩增反应获得的长单链DNA产物和四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr自组装形成的DNA正四面体；

所述滚环扩增反应包括锁式探针；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列，以使滚环扩增产物中含有靶标特异性的适配体序列；

所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr具有以下结构：

1）各条DNA单链序列由三个链间两两互补序列A、B、C，两个非互补短铰链序列a、b，一个非互补长铰链序列c，以及一个连接臂序列X组成；

2）各条DNA单链序列中序列A、B、C是长度17nt且无重复的核酸序列，序列a、b是长度2nt且无重复的核酸序列，序列c是长度6nt的重复T核酸序列，序列X是长度为18nt与RCA长单链DNA产物中各单元序列互补的核酸序列；

3）各条DNA单链序列由5’端至3’端方向，是按照序列A、序列a、序列B、序列b、序列C、序列c和序列X的顺序依次排列的核酸序列；

所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中还包括下述结构：

1）所述DNA单链Tar中Tar-A序列与Tcr-A序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补；

2）所述DNA单链Tbr中Tbr-A序列与Tdr-A序列互补，Tbr-C序列与Tcr-C序列互补；

3）所述DNA单链Tcr中Tcr-B序列与Tdr-B序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中为如下结构：

1）所述Tar序列为序列表中的SEQ ID NO：3所示核酸序列；

2）所述Tbr序列为序列表中的SEQ ID NO：4所示核酸序列；

3）所述Tcr序列为序列表中的SEQ ID NO：5所示核酸序列；

4）所述Tdr序列为序列表中的SEQ ID NO：6所示核酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：

1）分别量取等量的四条DNA单链于PCR管中，加入TEM 缓冲液，分别制备浓度为80 μM和100 μM 的TDN体系；90-98℃孵育，然后快速降温，保存备用；

2）按照RCA反应常规步骤，制备反应时间分别为10 h、8 h、6 h、4 h 的RCA产物，保存备用；

3）将TDN体系和RCA体系按照1:1（v/v）混合，用枪头手动混匀后，90-98℃孵育，自然冷却至室温，即可获得DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。

4.如权利要求3所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，还包括装载包埋物与纯化步骤，具体为：

1）将包埋物水溶液与透明的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶在混匀仪中常温避光孵育，离心孵育，随后将上清和胶体分离；

2）将分离出的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶浸入ddH₂ O中一定时间；

3）去除上清，剩下即为纯化装载完毕的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。

5.如权利要求3的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述滚环扩增反应包括连接反应和扩增反应两部分；

所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列；

所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增，获得长单链DNA产物。

6.如权利要求1-5任一所述制备方法制备的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的应用，其特征在于，可通过靶标响应释放包埋物进行可视化检测。