[发明专利]DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法

说明书

本发明建立了一种DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法。该方法将快速自组装成的DNA正四面体（TDN）和滚环扩增（RCA）产物相结合，仅需10min即可获得双交联水凝胶，解决了RCA技术制备DNA水凝胶耗时长的问题。同时，TDN的双链结构大大增强了水凝胶网络的机械强度，并为染料、药物等包埋物的高效搭载提供嵌合位点。此外，双交联水凝胶微观上具有由纳米花密集交联形成的蜂巢状结构，其致密度与纳米花的粒径大小可通过TDN浓度和RCA反应时间进行调节，实现了微观形貌可控。本发明实现了快速制备具有包埋物搭载高效、形貌可控、通用性强等优点的TDN‑RCA产物双交联水凝胶，在分子检测、药物装载与递送等方面，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法。

背景技术

基于RCA技术制备核酸水凝胶的方法存在耗时长、水凝胶机械强度低，不易搭载包埋物，导致可利用率低的问题。同时，RCA水凝胶的微观结构呈纳米花单一形貌，制备过程种难以对其大小及形貌结构进行调控，极大的限制了DNA水凝胶的推广应用。通过引入核酸自组装的DNA正四面体（TDN）高级结构能够有效弥补RCA技术制备核酸水凝胶的不足，为DNA水凝胶的制备提供了新的思路。一方面，由于TDN能够快速自组装，且以刚性的DNA双链为主要结构，因此直接解决了仅通过RCA技术制备DNA水凝胶耗时长、长单链产物机械强度低的问题，仅需10min即可获得高粘弹性的双交联水凝胶。另一方面，DNA水凝胶的合成对核酸链的长度和浓度具有一定的依赖性，通过将RCA长单链产物与TDN结合的方式显著降低了单一核酸结构制备DNA水凝胶所需的核酸量，从而进一步克服了核酸人工合成成本高对DNA水凝胶应用开发的限制。此外，TDN中的双链结构适合染料、药物等包埋物的嵌入，为DNA水凝胶中装载包埋物提供大量位点，拓宽了DNA水凝胶的应用方式。

发明内容

本发明建立的核酸水凝胶制备的新方法，克服了现有水凝胶制备方法的不足，实现了快速、简单高效、包埋物高效装载、形貌可控的核酸水凝胶的制备。

本发明的一个目的是提供一种制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术, 所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；

所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。

所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。

所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。

所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列，公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。

具体的，所述方法还包括下述1）-3）中的至少一种：

1）所述体外核酸扩增技术包括滚环扩增反应，所述滚环扩增反应的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；

2）所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，反应过程包括：16～30℃，20min～3h；

3）所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增的过程，反应过程包括：30～37℃，10h～30h。

4）所述锁式探针包括具长链结构且5’端经过磷酸化修饰的化合物。

再具体的，5’端磷酸化修饰的化学结构为：

具体的，所述方法还包括下述1）-6）中的至少一种：