[发明专利]一种髓母细胞瘤细胞的3D培养方法及其在药物筛选中的应用

说明书

本发明公开了一种髓母细胞瘤细胞的3D培养体系及其培养方法和在药物筛选中的应用；所述髓母细胞瘤细胞的3D培养体系，包括3D羟丙基纤维素微孔支架和髓母细胞瘤3D球样体专用培养基，所述3D球样体专用培养基为基础培养基添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸；本发明3D肿瘤模型具有较佳生长优势，同时可在长时间稳定保持其球样体形态以及关键蛋白的表达，改进了平面培养体系可能导致的细胞基因、蛋白、药物易感性等各方面的缺陷，更加准确地反映体内肿瘤的状况并预测药物的药效，为临床髓母瘤治疗药物的筛选提供更准确的技术和数据支持。

技术领域

本发明涉及一种细胞的培养方法及其应用，具体涉及一种髓母细胞瘤细胞的3D培养方法及其应用。

背景技术

髓母细胞瘤(Medulloblastoma，MB)是最常见的恶性小儿脑肿瘤。随着临床医学和基础研究的发展，手术联合放疗再辅以化药治疗的综合治疗措施成为主流的髓母细胞瘤疗法，可以帮助延长MB患者的生存期并改善其生活质量。然而，手术切除不完全导致的复发风险以及放疗对于发育期大脑的潜在损害仍然是髓母瘤临床治疗的两大痛点。因此，化疗药物仍是重要的辅助治疗手段。目前常用的化疗药物包括顺铂和长春新碱等，但二者的使用常伴有各种难以逆转的神经毒性，如腱反射丧失和听力丧失等，如何快速筛选有效且低毒的新型化疗药物是MB治疗的焦点问题。

当前常用于MB药物筛选的模型包括细胞模型、人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)和基因工程小鼠模型。PDX模型和基因工程小鼠模型成本高，建模周期长，难以实现快速、高通量的药物筛选，人与动物之间的种属差异也会导致假阳性、假阴性结果的出现。因此，操作简单、成本低，结果重复性高的细胞模型，是目前最常用的MB体外模型。然而，现有细胞体外模型的培养方式是传统二维(2D)细胞培养，无法模拟细胞在体内多维生长的真实情况，更无法重现细胞间相互作用以及复杂的肿瘤微环境，在药效筛选方面有着较大的局限性，通过2D模型得到的筛选数据很难转换为临床有效的治疗方案。

三维(3D)细胞培养技术的发展使得细胞球样体模型成为一种更具有预测性的肿瘤体外药物筛选模型。现有构建髓母细胞瘤3D球样体的方法分为两类，第一类是低黏附培养法。Bassani团队将髓母细胞瘤细胞DAOY经低黏附板培养后形成的球样体用于芬维A胺的药效机制研究；Ivanov团队利用低黏附培养板将髓母细胞瘤细胞UW-228与人神经干细胞共同培养形成细胞球样体，从而模拟髓母细胞瘤术后病灶处的药物递送，但上述报道并未进行药物筛选实验。此外，由于低黏附平面不能提供支撑，随机形成的球样体难以达到均一的大小和形状，在日常的培养以及换液过程中也会导致球样体的损失，这种不确定性一定程度上限制了其应用。第二类为水凝胶基质法。Roper团队通过制备透明质酸与聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的混合物来模拟脑部细胞外基质，并将DAOY细胞封装于上述基质中培养，得到的髓母细胞瘤3D模型用于研究药物反应，但水凝胶本身特性受分子量的影响较大，再加上天然基质中不确定成分较多，不同批次的水凝胶组成也可能存在差异，从而影响药物筛选实验的准确性和重复性。

3D羟丙基纤维素微孔支架可以很好地克服上述困难，这种细胞支架具有较好的再现性和一致性，支架中特有的孔和通道的排列可在体外高度模拟体内微环境，譬如细胞间相互作用以及营养成分、代谢废物的交换等。此外，它的多层结构可为球样体的生长提供支撑，有效提高细胞球的培养面积，从而极大地提高细胞球样体的产率。目前利用羟丙基纤维素微孔支架作为细胞支架材料的报道主要集中于肝脏模型的构建，未见用于脑肿瘤模型及药物筛选的报道。因此，本发明基于其生物相容性高、成分稳定的优点，首次利用羟丙基纤维素微孔支架作为细胞支架，构建了髓母细胞瘤的体外3D细胞模型并用于药物筛选。

发明内容

本发明的目的在于解决现有研究的不足，提供一种髓母细胞瘤3D球样体模型的制备方法和应用。所述模型由羟丙基纤维素和烯丙基异氰酸酯反应形成的具有均匀多孔结构的支架材料即羟丙基纤维素微孔支架构建，操作简单，不需要额外的设备，细胞成球率高，在21天内可以稳定维持球样体外观、细胞活力与关键蛋白表达。