[发明专利]一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：引物确定：引物包括外围引物、扩增引物和测序引物，具体序列如下：

上游外围引物NSA3F：5'-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3'；

下游外围引物NLC2R：5'-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3'；

上游扩增引物ITS5F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；

下游扩增引物ITS4R：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

上游测序引物ITS1F：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

下游测序引物ITS4R：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

S2：PCR条件确定：根据引物的Tm值确定PCR条件为，94℃/5min变性，94℃/30变性，50℃/55℃/30S退火，72℃/1min延伸，总循环为40个循环；

S3：样本DNA提取：

样本选择人体组织液；

S4：巣式PCR扩增：

巣式PCR扩增的反应体系为20µl体系，其中，样本采用S3获得的洗脱基因组DNA，扩增条件参照S2，巣式PCR扩增所使用的引物采用S1中的序列；

S5：琼脂糖凝胶电泳检测：

琼脂糖凝胶电泳所采用样品为S4获得的PCR产物；

S6：目的片段产物的纯化

对S5中PCR结果为阳性的目的片段产物电泳样本进行胶回收纯化；

S7：T-A克隆及电泳检测

克隆样本为步骤S6获得的DNA溶液，克隆获得的菌落重复步骤S3、S4、S5依次进行DNA提取、巣式PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测；

S8：测序：取50µl S7中条带正确的阳性样本送测序公司测序；

S9：同源进化树分析：采用邻接法对S8测序序列构建同源进化树，确定真菌种类。

2.根据权利要求1所述的一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，其特征在于：样本DNA提取具体操作步骤如下：

①用移液枪吸取120µl样本加入1.5ml离心管中；

②向样本中加入500µl Buffer AP1，盖紧离心管盖子，涡旋震荡15s；

③向离心管中加入100µl AP2，涡旋震荡15s后放置5min使其充分裂解得到样本DNA；

④将裂解好的样本DNA进行离心，12000×g离心10min；

⑤将制备管置于2ml离心管中，将步骤④中离心好的样本DNA加入到制备管中，放置3min使DNA和制备管内的吸附膜充分结合，12000×g离心1min；

⑥弃滤液，向制备管中加入700µl Buffer W1A，室温放置2min，12000×g离心30s；

⑦弃滤液，向制备管中加入800µl已加入无水乙醇的Buffer W2，Buffer W2与无水乙醇的添加比例为1:4，12000×g离心1min；

⑧弃滤液，向制备管中加入500µl Buffer W2到制备管中，12000×g离心1min；

⑨弃滤液，将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min，通过空甩将制备管中多余的液体去除；

⑩将制备管置于另一洁净的1.5ml的离心管中，放置10min使制备管内的无水乙醇完全挥发，然后向制备管中加入60µl预热到65℃的Buffer TE，室温静置2min，12000×g离心1min，弃上清液获得洗脱基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，其特征在于：巣式PCR扩增的反应体系组成为：rTaq酶：10µl，RNase Free dH₂O：6µl，Primer F（10µm）：1µl，Primer R（10µm）：1µl，样本：2µl。