[发明专利]一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法

说明书

一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，包括以下步骤：S1：引物确定：包括外围引物、扩增引物和测序引物；S2：PCR条件确定：根据引物的Tm值确定；S3：样本DNA提取：样本选择人体组织液；S4：巣式PCR扩增：巣式PCR扩增的反应体系为20µl体系；S5：琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖凝胶电泳样品为S4获得的PCR产物；S6：目的片段产物的纯化对S5中PCR结果为阳性的目的片段产物进行胶回收纯化；S7：T‑A克隆及电泳检测克隆样本为步骤S6获得的DNA溶液；S8：测序：取S7中条带正确的阳性样本测序；S9：同源进化树分析：对S8测序序列构建同源进化树，确定真菌种类。本发明采用分子生物学技术进行马尔尼菲篮状菌的鉴定，鉴定效率高，为疾病的早期治疗提供可靠的依据。

技术领域

本发明涉及马尔尼菲篮状菌鉴定技术领域，特别与一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法相关。

背景技术

HIV是一种主要侵入人体免疫系统细胞的逆转录病毒。它可以破坏体内的T淋巴细胞，从而阻断细胞免疫过程，削弱机体的免疫功能，导致病人免疫缺陷，继而发生机会性感染、恶性肿瘤等。自从1981年美国报道全球第一例艾滋病以来，艾滋病在全世界范围内迅速蔓延。

随着近几年人类免疫缺陷病毒（HIV）感染患者的增多，在东南亚马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei，TM）引起的临床感染仅次于结核杆菌和新型隐球菌，居第三位，是引起艾滋病患者感染的主要致病菌。TM在东南亚已成为隐球菌之后的第2种较常见的条件致病性真菌。现有的TM鉴定方法多采用真菌培养，通过比对真菌性状确定真菌种类，由于鉴定方法简单鉴定率不到50%。

本发明针对云南省传染病专科医院（昆明医科大学附属传染病医院）送检的HIV患者机会性感染的样本，采用真菌通用引物及设计的特异性真菌扩增引物，进行PCR扩增，进行真菌的分子生物学检测及基因分型分析，探索和建立适合临床推广的侵袭性真菌感染的早期诊断方法。

发明内容

针对相关现有技术存在的问题，本发明提供一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，采用分子生物学技术进行马尔尼菲篮状菌的鉴定，鉴定效率高，应用于临床实验可在患者发病初期进行疾病的鉴定，灵敏度高，为疾病的早期治疗提供可靠的依据。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术：

一种马尔尼菲篮状菌的分子鉴定方法，包括以下步骤：

S1：引物确定：引物包括外围引物、扩增引物和测序引物，具体序列如下：

上游外围引物NSA3F：5'-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3'；

下游外围引物NLC2R：5'-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3'；

上游扩增引物ITS5F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；

下游扩增引物ITS4R：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

上游测序引物ITS1F：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；

下游测序引物ITS4R：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

S2：PCR条件确定：根据引物的Tm值确定PCR条件为，94℃/5min变性，94℃/30变性，50℃/55℃/30S退火，72℃/1min延伸，总循环为40个循环；

S3：样本DNA提取：

样本选择人体组织液；

S4：巣式PCR扩增：

巣式PCR扩增的反应体系为20µl体系，其中，样本采用S3获得的洗脱基因组DNA，扩增条件参照S2，巣式PCR扩增所使用的引物采用S1中的序列；

S5：琼脂糖凝胶电泳检测：

琼脂糖凝胶电泳所采用样品为S4获得的PCR产物；

S6：目的片段产物的纯化

对S5中PCR结果为阳性的目的片段产物电泳样本进行胶回收纯化；