[发明专利]一种基于crispr-cas12f1检测病原微生物RNA的方法

说明书

本发明是基于RT‑PCR和T7 RNA转录扩增技术结合crispr‑cas12f1酶被RNA激活后附带反式切割能力而开发的一种方法，具体涉及病原微生物的快速诊断领域，本方法解决了病原微生物RNA碱基突变而造成的检测能力差的问题，丰富了crispr‑cas121系统在检测领域的应用。

技术领域

一种基于crispr-cas12f1系统检测病原微生物RNA的方法，其特征在于：检测病原微生物具有较好特异性。

背景技术

病原微生物种类繁多，对人类，动植物危害较大，对于病原微生物的检测方法主要集中于培养法，荧光定量PCR，微生物测序。近年来CRISPR/Cas(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR associated)系统的发现为微生物检测提供了高特异性高灵敏度的方法。crispr/cas系统是古细菌和细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫抵御，可用来对抗入侵的病毒以及外源DNA。Crispr/cas系统主要分为2大类，包括有class1和class2，其中class1是利用多蛋白效应复合物，class2是单一蛋白效应器，结合引导RNA形成复合物而发挥靶向切割的能力，Class2包括II，V，VI类型，包括有cas9，cas12，cas13和cas12f1系统(Koonin, E. V., Makarova, K. S. (2019).Origins and evolution of CRISPR-Cas systems. Philosophical Transactions ofthe Royal Society B, 374(1772), 20180087.)。目前用于检测方法应用的多集中于cas9，cas12和cas13系统，其中crispr/cas9系统具有依赖PAM位点的靶向切割双链DNA能力，根据此功能，Zhou等人将cas9蛋白的RUVC或HNH结构的一个关键位点突变，进而使得cas9蛋白形成一个具有类似缺口酶的功能，同时结合链替换技术获得高灵敏度的检测方法(Zhou, W., Hu, L., Ying, L., Zhao, Z., Chu, P. K., Yu, X. F. (2018). ACRISPR–Cas9-triggered strand displacement amplification method forultrasensitive DNA detection. Nature communications, 9(1), 1-11.)。Crispr/cas12系统可以靶向切割带有PAM位点(TTTN)的双链DNA，单链DNA或者ssRNA，同时其还具有反式切割的能力，该能力被广泛的应用到检测领域，例如，Wang等人通过将探针的一端修饰为蓝光可见分子设计出可视化的检测病毒的方法，其主要通过恒温扩增技术使得目标靶链发生指数增加，待cas12a发生反式切割后，其探针一端的蓝光可见分子得到释放，在蓝光的照射下，发出蓝光。该系统具有良好的检测灵敏度，其灵敏度可以达到100aM(Wang, B.,Wang, R., Wang, D., Wu, J., Li, J., Wang, J., ... Wang, Y. (2019).Cas12aVDet: a CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic aciddetection. Analytical chemistry, 91(19), 12156-12161.)。crispr/cas13系统具有切割单链RNA的能力，具有反式切割RNA的能力而被广泛应用到生物传感检测体系，例如，Myhrvold等人设计一段带有T7启动的引物进行恒温扩增，并通过T7转录获得ssRNA靶链，开发 SHERLOCK的检测方法，该方法具有减少时间短，高灵敏度特异性的特点(Myhrvold, C.,Freije, C. A., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Metsky, H. C., Durbin, A.F., ... Sabeti, P. C. (2018). Field-deployable viral diagnostics usingCRISPR-Cas13. Science, 360(6387), 444-448.)。而目前已知crisp/cas14系统具有靶向切割带PAM位点的双链DNA和单链DNA以及具有反式切割的能力，但由于其特异性识别位点在靶向单链DNA区域的第11-12位的碱基，而其他的靶向位点特异性差，这大大限制了该体系的应用(Harrington, L. B., Burstein, D., Chen, J. S., Paez-Espino, D., Ma,E., Witte, I. P., ... Doudna, J. A. (2018). Programmed DNA destruction byminiature CRISPR-Cas14 enzymes. Science, 362(6416), 839-842. Karvelis, T.,Bigelyte, G., Young, J. K., Hou, Z., Zedaveinyte, R., Budre, K., ... Siksnys, V. (2020). PAM recognition by miniature CRISPR–Cas12f nucleasestriggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic acidsresearch, 48(9), 5016-5023.)。本发明利用RT-PCR和T7 RNA转录技术合成RNA短链，同时以RNA为目标底物引起cas12f1反式切割而开发出一套高灵敏度高特异性的检测病原微生物的检测方法，拓宽了该系统的应用。