[发明专利]一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法

权利要求书

1.一种荧光自抑制探针的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统包括荧光自抑制探针、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲液、反应原料与miRNA目标分子；其中，所述荧光自抑制探针与miRNA目标分子杂交结合，所述荧光自抑制探针包括荧光自抑制线性探针与荧光自抑制发夹探针。

2.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针的结构中包括淬灭碱基、淬灭基团与荧光基因，其中淬灭碱基与淬灭基团实现双重淬灭的功能。

3.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针的结构中包括淬灭基团与荧光基因，其中荧光基团和淬灭基团的碱基互补配对，所述荧光自抑制发夹探针的序列3’端含有所述miRNA目标分子对应的结合区域和特异性酶切识别序列。

4.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针采用如SEQ ID NO.1所示的序列，

SEQ ID NO.1:5’-CCCGTGGAGTCTGTG-(Quencher)-I-(Fluorophore)-NNNNNNNNNN-3’，

所述荧光自抑制线性探针的碱基序列包括适用于不同miRNA目标分子的通用碱基序列，以及与特定miRNA目标分子结合的特异性互补碱基序列；所述荧光自抑制线性探针的通用碱基序列为CCCGTGGAGTCTGTG和I，所述荧光自抑制线性探针的特异性互补碱基序列为N碱基重复序列；所述荧光自抑制线性探针还包括荧光基团、淬灭碱基和淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制线性探针中，所述荧光基团(Fluorophore)为6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H-吲哚菁(Cy5)中的一种或多种，优选为6-羧基荧光素(FAM)；所述淬灭基团(Quencher)为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种，优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)；所述淬灭碱基(I)为A、G、C、T中的一种或多种，优选为G。

6.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针采用如SEQ ID NO.2所示的序列，

SEQ ID NO.2：5’-(Quencher)-ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA-(Fluorophore)-AAAGAGTCTGTGNNNNNNNNNN-3’，

所述荧光自抑制发夹探针的碱基序列包括适用于不同目标产物的通用碱基序列，以及与不同目标产物结合的特异性互补碱基序列，其中，所述荧光自抑制发夹探针的特异性互补碱基序列为N碱基重复序列，所述荧光自抑制发夹探针的通用碱基序列为ATTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAA与AAAGAGTCTGTG；所述荧光自抑制发夹探针还包括荧光基团和淬灭基团。

7.根据权利要求6所述的等温扩增系统，其特征在于，所述荧光自抑制发夹探针中，所述荧光基团(Fluorophore)为6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、ROX(ROX)、6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)、5H-吲哚菁(Cy5)中的一种或多种，优选为6-羧基荧光素(FAM)；所述淬灭基团(Quencher)为黑洞猝灭基团1(BHQ1)、黑洞猝灭基团2(BHQ2)、和4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)中的一种或多种，优选为黑洞猝灭基团1(BHQ1)。

8.根据权利要求1所述的等温扩增系统，其特征在于，所述等温扩增系统中的缓冲液包括Tris-HCl(pH 7.9@25℃)、NaCl、MgCl₂与DTT。