[发明专利]一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法

说明书

本发明提供一种荧光自抑制探针的等温扩增系统及方法，所述等温扩增系统包括两种荧光自抑制探针组合、Vent DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻内切酶、缓冲液、反应原料和miRNA目标分子。其中，荧光自抑制探针包括一种荧光自抑制线性探针和一种荧光自抑制发夹探针。本发明还提供了上述等温扩增系统的扩增方法。本发明的荧光自抑制探针等温扩增系统和扩增方法，能够显著降低探针的本底荧光信号，并极大提高检测信噪比，有利于样本中痕量miRNA靶标的检出。同时，两种无背景荧光探针之间无互补序列，可防止探针之间的错配和延伸，有效提高检测的特异性，避免假阳性结果的出现，特别适合临床样本中miRNA分子标志物的直接检测。

技术领域

本发明涉及医学检测和分子诊断技术领域，尤其涉及一种用于痕量miRNA快速检测的荧光自抑制探针的等温扩增系统和扩增方法。

背景技术

微小核糖核酸(miRNA)是一类长度约为18-24个核苷酸的单链非编码RNA，不编码蛋白质，但是能够广泛参与基因的调控。目前，循环miRNA已经被证明可以作为肿瘤早期检测、疗效监测重要的分子标志物，用于癌症的早期筛查和预后诊疗。通常，循环肿瘤miRNA分子标志物在人体液中的含量较低，同时会受到体液中其他核酸分子的干扰。更重要的是，多个miRNA分子标志物联合使用，会极大提高肿瘤早筛和诊断的准确率。因此，这些都对miRNA检测方法的灵敏度、特异性、以及单样本多靶标检测的性能提出了较高的要求。

过去，聚合酶链式反应(PCR)是用于miRNA检测的常用技术。然而，PCR扩增技术仍然存在诸多难以克服的弊端。例如：1)PCR无法直接检测miRNA目标分子，需要经历逆转录过程；2)PCR扩增所用的酶耐受性较差，对模板的纯度要求较高；3)PCR扩增是一种连续变温的反应，对设备的温度控制和精度要求甚高；4)PCR检测高度依赖精密的分析设备，无法在实验室以外的环境开展实验；5)PCR检测耗时较长，无法满足临床应用场景快速检测的需求；6)PCR检测灵敏度相对较低，一般只能检测大于10拷贝的目标分子，无法实现极低浓度靶标的检出；因此，开发检测灵敏度更高、特异性更强、单样本多靶标检测性能更优的miRNA快速检测方法将具有更广泛的临床应用价值。

等温扩增是一种新型的核酸扩增技术，其特点是反应全程始终维持在恒定的温度下进行，通过添加不同活性、不同功能的酶，以及特异性引物或探针来实现核酸的快速扩增目的。等温扩增技术发现之初，主要用于DNA双链的检测及应用。随后，研究表明等温扩增技术特别适合miRNA这类长度较短的单链RNA的检测，可以在30～60分钟内，实现10⁹倍及以上目标基因的扩增。然而，目前大多等温扩增技术，如环介导等温扩增术(LAMP)在整个反应过程中，需要同时使用4-6条引物，且引物长度较长，相互之间还会存在互补重叠区域，容易产生非特异性扩增、并出现假阳性结果。同时，由于miRNA目标分子检测的特殊性，多数等温扩增技术仍采用染料法，既增加了非特异性扩增的概率，又无法实现单样本多靶标的应用需求。因此，极大地限制了等温扩增技术在miRNA分子标志物检测的应用。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有等温扩增技术灵敏度低、特异性差、检测效率低等缺陷，提供一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统和扩增方法，能够有效降低反应前探针的荧光背景信号，同时降低探针之间的错配和非特异性延伸，显著提高用于miRNA快速检测等温扩增方法的特异性和灵敏度。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种基于荧光自抑制探针的等温扩增系统，所述等温扩增系统包括荧光自抑制探针、DNA聚合酶、切刻内切酶、缓冲液、反应原料与miRNA目标分子等。其中，所述荧光自抑制探针与miRNA目标分子之间杂交结合，触发反应的开始。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述等温扩增系统采用荧光自抑制线性探针和荧光自抑制发夹探针。