[发明专利]一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用

权利要求书

1.一种产磷脂酶D的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.一种产磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)磷脂酶D基因密码子的优化

选择基因序列如SEQ ID NO.1所示的链霉菌来源的磷脂酶D基因进行密码子优化，得到适合在毕赤酵母中高效表达的基因序列；

(2)磷脂酶D基因糖基化位点分析

将优化过的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；

(3)糖基化位点定点突变及全基因合成

为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的天冬酰胺变为谷氨酰胺，并将密码子优化及糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(4)初步工程菌的获得

将步骤(3)完成的序列连接在pPIC9K载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入DH5a菌株获得初步工程菌；

(5)pPIC9K-PLD质粒的抽提

对步骤(4)得到的初步工程菌进行质粒提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量，检测合格的pPIC9K-PLD质粒继续用于后续实验；

(6)毕赤酵母GS115细胞的转化

制备毕赤酵母GS115感受态细胞，并将线性化的pPIC9K-PLD和pPIC9K质粒利用电转方法转入GS115酵母感受态细胞；所述线性化pPIC9K-PLD和pPIC9K质粒的获取方法为：选择线性化酶切位点为Stu I，并建立如下酶切反应体系：50μL pPIC9K-PLD/pPIC9K，4μLQuickCut^TMStu I，20μL10×QuickCut^TMbuffer，添加无菌水至200μL；最后，37℃保温1h，琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切彻底；

(7)pPIC9K-PLD重组阳性转化子的鉴定

挑取不同的pPIC9K-PLD重组转化子单克隆进行PCR鉴定；将鉴定为阳性的菌株克隆扩大培养，即为目标所需的产磷脂酶D的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用在线密码子优化软件不改变蛋白编码序列，将原始的磷脂酶基因三联体密码子中最后一个碱基改为酵母密码子偏爱的碱基；所述步骤(2)中，利用NetNGlyc 1.0Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。

4.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中，毕赤酵母GS115感受态细胞的制备方法如下：

①将保存在15％甘油中GS115菌株从-80℃冰箱取出，用接种环蘸取菌液，在YPD平板上进行划线，30℃培养2天；

②从YPD平板上挑取单克隆于5mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm条件下振荡培养2天；

③按照1％接种量，将培养2天的菌液接种到100mL/250mL YPD液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝1.3-1.5之间；

④用10mL无菌离心管收集细胞；离心条件为：4℃，1500×g，离心5min，菌液8mL；

⑤用8mL预冷无菌水重悬并离心收集细胞；离心条件为：4℃，1500×g，离心5min；

⑥用4mL预冷无菌水重悬并离心收集细胞；离心条件为：4℃，1500×g，离心5min；

⑦用4mL 1M预冷无菌山梨醇重悬并离心收集细胞；离心条件为：4℃，1500×g，离心5min；

⑧加入预冷的160μL 1M预冷无菌山梨醇重悬细胞，取80μL细胞分装到1.5mL管中，冻存于-80℃冰箱备用。