[发明专利]一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种产磷脂酶D的基因工程菌。本发明还提供了上述产磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，方法如下：优化磷脂酶D基因密码子、分析磷脂酶D基因糖基化位点、糖基化位点定点突变及全基因合成、获得初步工程菌、质粒抽提、毕赤酵母细胞转化、重组阳性转化子的鉴定。同时，本发明还提供了上述产磷脂酶D的基因工程菌在sdLDL‑C检测试剂盒开发中的应用。本发明的优点在于：本发明构建的产磷脂酶D的基因工程菌能够高效表达PLD蛋白，水解酶活达115.2U/mL，且实现了其对现有sdLDL‑C检测试剂盒中PLD的替代，大大降低相应试剂盒的生产成本。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D，简称PLD，EC 3.1.4.4)是作用于磷脂分子中磷酸与有机碱间磷酰氧键(P-O)的一类酶。作为磷酸二酯酶超家族的一员，PLD是催化磷脂水解第一步反应的关键酶之一，参与细胞脂质代谢、信号转导及生物膜形成等。此外，它还可以催化各种羟基化合物与磷脂碱基结合形成新的磷脂，这一重要的特性称为磷脂酶D的碱基交换反应(Base exchange reaction)，也称为转磷脂反应(Transphosphatidylation)。利用PLD的这一重要特性可以合成稀有磷脂(如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及新型甘油醚磷脂等)、新型药物释放系统等。因此，PLD被广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。

磷脂酶D广泛分布于病毒、动物、植物和微生物中。由于具有较好的转磷脂活性、较广泛的底物特异性和较强的底物耐受性，微生物来源的磷脂酶D在工业生产中的应用较为广泛。

自20世纪70年代以来，已报道的PLD主要来源于革兰氏阳性菌，包括链霉菌属(Streptomyces)、轮枝链霉菌属(Streptoverticillium)、芽胞杆菌属(Bacillus)和棒状杆菌属(Corynebacterium)等。其中，链霉菌来源的PLD是目前报道最多的，且它们具有较好的水解和转磷脂活性。此外，少数酵母菌和丝状真菌也能生产PLD，包括酵母(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccaromyces)和镰刀菌属(Fusarium)等。

目前，国外对微生物PLD的研究已较为成熟，一些酶制剂公司已筛选出高产PLD的链霉菌菌株。但链霉菌较长的生长周期(近7d)给实际生产和应用带来了许多困难，而且商品化PLD的价格非常昂贵，如Sigma-Aldrich公司的Streptomyces sp.PLD酶制剂，每毫克售价约一千元人民币左右。而目前国内由微生物发酵制备PLD的研究才刚刚起步，基本上都停留在实验室水平，还没有相关的PLD产品。对进口酶源的高度依赖严重影响了我国下游产业的发展，包括体外诊断试剂的自主研发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL-C检测试剂盒开发中的应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种产磷脂酶D的基因工程菌，所述基因工程菌包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一种产磷脂酶D的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)磷脂酶D基因密码子的优化

选择基因序列如SEQ ID NO.1所示的链霉菌来源的磷脂酶D基因进行密码子优化，得到适合在毕赤酵母中高效表达的基因序列；

(2)磷脂酶D基因糖基化位点分析

将优化过的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；

(3)糖基化位点定点突变及全基因合成