[发明专利]飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

权利要求书

1.飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，包括以下步骤：

S1样品处理：取待检测样品的DNA两份，一份直接进行进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品1；另一份依次经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化后，再进行亚硫酸氢盐转化的样品为样品2；

S2引物设计：针对待检测的甲基化区域，设计一对特异性甲基化引物，两条引物的5’端分别加上Tag序列，其中下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列；

S3扩增：用设计的特异性甲基化引物，同时对样品1和样品2进行扩增；

S4酶切：扩增产物经过虾碱酶消化，用T7转录酶进行体外转录并用RNaseA进行酶切。酶切产物经树脂纯化后上质谱仪检测。通过酶切片段的分子量大小得到待测位点是C还是T，从而计算待测位点的甲基化程度。

S5比较：比较同一待测位点在样品1和样品2中甲基化差异，得到5hmC的甲基化结果。

2.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S1中的初步纯化中，纯化试剂为Micro Bio-Spin^TMP-6 Gel Columns,SSC Buffer。

3.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S1中初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化的过程中使用的水为无DEPC的纯水。

4.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S1中高钌酸钾氧化中，根据样品的颜色和状态判断氧化的成功与否，氧化成功的样品的颜色和状态保持不变。

5.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S1中，氧化产物纯化中的纯化试剂为Micro Bio-Spin^TMP-6 Gel Columns,SSC Buffer。

6.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S1中，样品2的亚硫酸氢盐转化时间长于样品1的亚硫酸氢盐转化时间。

7.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S2引物设计中，所述上游引物的Tag的作用是为了增加引物的分子量，使之超过质谱仪检测范围，避免对产物检测造成干扰；所述下游引物添加的Tag包含T7转录启动子序列，其作用是为了后续启动T7转录酶进行转录反应。

8.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S4酶切中，所述虾碱酶消化之作用为除去体系中残留的dNTP，随后经过T7转录和RNaseA酶切，得到小片段RNA。得到的产物经树脂纯化后做飞行时间质谱，通过产物的分子量得到待测位点是C还是T，从而得到待测位点的甲基化程度。

9.根据权利要求1所述的的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S5具体为，样品2经过经过初步纯化、氢氧化钠变性、高钌酸钾氧化、氧化产物纯化、亚硫酸氢盐转化后，得到5mC的甲基化检测结果；样品1经过常规亚硫酸氢盐转化后，得到5mC+5hmC的甲基化检测结果；对两份检测结果进行比较，从而得到5hmC的检测结果。

10.根据权利要求1所述的飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法,其特征在于，所述步骤S2引物设计中，所述特异性甲基化引物中的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。