[发明专利]飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

说明书

本发明是基于飞行时间质谱法联合氧化亚硫酸氢盐转化法建立的5‑羟甲基胞嘧啶的检测方法。相比较传统的亚硫酸氢盐转化检测甲基化方法，本方法在亚硫酸氢盐转化之前引入高钌酸钾氧化法，主要是利用高钌酸钾的强氧化作用，把5hmC转化为5‑甲酰基胞嘧啶5fC，然后在亚硫酸氢盐转化中5fC转化为尿嘧啶U，并在后续的PCR过程中转变成T；相对应的，5mC不被亚硫酸氢盐转化，在PCR中仍表现为C，所以检测到的C只是5mC；相比传统方法，本方法是一种简单可靠、准确而低成本对5hmC进行定量分析的方法。

技术领域

本发明属于5-羟甲基胞嘧啶检测领域，特别涉及一种飞行时间质谱检测5-羟甲基胞嘧啶的方法。

技术背景

甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。我们所要研究的就是对脱氧核糖核酸DNA进行修饰形成的甲基化。

脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)，胞嘧啶C转化为5-甲基胞嘧啶5mC，这是由一个被称为DNA甲基转移酶并包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的酶家族催化。DNMT3a和DNMT3b是从头合成的甲基转移酶，能够甲基化之前未甲基化的CpG二核苷酸。相反，DNMT1是一种维持性甲基转移酶，在复制过程中修饰半甲基化的DNA。

人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化，这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。1％-2％的人类基因组是CpG岛，并且CpG甲基化与转录活性成反比，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)，但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

目前，将5mC视作一个完全稳定的DNA修饰这一想法尚不实际。整个基因组中的许多甲基化胞嘧啶，特别是基因体内的甲基化胞嘧啶，都会经历一个被称作DNA去甲基化的过程-这一过程最终会去除5mC，将甲基化胞嘧啶转化为未修饰的胞嘧啶(C)。DNA去甲基化能够通过以下两种方式中的任一种方式发生：DNA被动去甲基化：由于缺少甲基化维持酶，甲基化的胞嘧啶在基因组中被稀释掉。或DNA主动去甲基化：5mC被10-11易位(TET)酶氧化为5mC的氧化衍生物。

如图1所示，DNA主动去甲基化呈周期性，从5mC开始，以未修饰的C结束。5mC首先被氧化为5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)，再进一步被氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)，后者最后再一次被氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)。该过程涉及Tet酶家族，包括Tet1、Tet2和Tet3。接下来，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)与碱基切除修复(BER)共同将5fC和5caC从DNA中去除，产生一个未修饰的C。在该通路中，TDG可以修复5-hmC脱氨基后产生的5-羟甲基尿嘧啶。

在不同细胞周期中对5hmC含量的测定，显示5hmC是稳定的修饰，而不是瞬时中间体，而且还可以作为具有独特调节功能的表观遗传标记。例如，5hmC有自己独特的结合蛋白来读取其所携带的表观遗传信息，它还显示出与转录活性相关的独特基因组分布模式。同时对于小鼠不同组织中的hmC含量研究后，发现5hmC的含量也是稳定的，并与各组织的增殖代谢水平相关。

在人肝和肺的正常组织以及对应的肿瘤组织中对全基因组DNA甲基化和羟甲基化分析后，不但发现5hmC在CpG岛岸中显著富集，同时也发现在启动子，基因本体上的羟甲基化基因表达呈显著正相关，表明5hmC是活性基因的标记，可能通过介导DNA去甲基化调控基因表达。