[发明专利]利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法

权利要求书

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；

所述单链核酸检测器含有修饰的核酸，所述修饰的核酸为碱基修饰的核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：2’-Deoxynebularine，或Etheno-dA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器包含2-30个碱基修饰的核酸，优选的，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的核酸构成。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测、基于传感器的检测、颜色检测、基于金纳米颗粒的检测、荧光偏振、荧光检测、胶体相变/分散、胶体金检测、电化学检测和基于半导体的检测。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas12家族蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物。

5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团或标记分子，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的信号。

6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸；优选的，包括单链核酸、双链核酸，例如，单链DNA、双链DNA、单链RNA。

7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品；优选的，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸或与对照有差异的特异核酸，优选地，疾病相关的特异核酸为特定的突变位点或SNP位点；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，例如，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

8.一种切割碱基修饰的单链核酸的方法，其特征在于，使碱基修饰的单链核酸与靶核酸、V型CRISPR/CAS效应蛋白和gRNA(指导RNA)接触，gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b中的一种或多种组合，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白切割所述碱基修饰的单链核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：2’-Deoxynebularine，或Etheno-dA；所述gRNA不与所述碱基修饰的单链核酸杂交；优选的，所述单链核酸检测器包含2-30个碱基修饰的核酸；更优选的，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的核酸构成。

9.一种用于检测样品中靶核酸或切割碱基修饰的核酸的试剂、系统、组合物或试剂盒，所述试剂、系统、组合物或试剂盒包括权利要求1-7任一权利要求中所述的V型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器。

10.权利要求1-7任一权利要求中所述的V型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器，或者，权利要求9所述的试剂、系统、组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸或切割碱基修饰的核酸中的应用。