[发明专利]利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法

说明书

本发明提供了一种利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器，所述单链核酸检测器存在碱基修饰。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性 (SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs 的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、 LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK 技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR 技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

在基于CRISPR的核酸检测技术中，核酸探针或者核酸检测器是上述检测技术的关键元件，本发明对核酸探针进行了改进，从而扩展了该技术的应用范围。

发明内容

本发明提供了利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

方法

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

所述单链核酸检测器含有修饰的核酸，所述修饰的核酸为碱基修饰的核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：2’-Deoxynebularine，或Etheno-dA。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器包含2-30个碱基修饰的核酸，优选，所述单链核酸检测器包含3-15个碱基修饰的核酸，优选，所述单链核酸检测器包含5-10个碱基修饰的核酸，优选，5、6、7、 8、9、10个碱基修饰的核酸。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的核酸构成，优选的，所述单链核酸检测器的核酸由5-15个碱基修饰的核酸构成，优选的，所述单链核酸检测器的核酸由5-10个碱基修饰的核酸构成，优选，5、6、7、8、9、10个碱基修饰的核酸。

另一方面，本发明还提供了一种切割碱基修饰的核酸的方法，所述方法包括，使碱基修饰的核酸与靶核酸、V型CRISPR/CAS效应蛋白和gRNA(指导RNA)接触，gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述gRNA不与所述碱基修饰的核酸杂交。

在一个实施方式中，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白切割所述碱基修饰的核酸，