[发明专利]一种模拟酶辅助的汞离子检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种汞离子检测方法，组成成份包括发夹探针H1、氯化血红素、生色底物和终止液，其特征在于组成成份还包括辅助探针P、发夹探针H0，所述辅助探针P在汞离子存在时与所述发夹探针H0结合形成两个独立的脱氧核酶；所述辅助探针P和所述发夹探针H0序列结构中存在胸腺嘧啶，所述发夹探针H1环部修饰有核糖核苷酸rA裂解位点；所述辅助探针P的序列为SEQ ID No.1所示序列CTCTTCAGCGATCCTTCTTCTCTTCAGC，所述发夹探针H0的序列为SEQID No.2所示序列CTCTTCAGCGATCACCCATGTTAGTTCAGCTGAAGAGTTGTTGGCACCCATGTTAGTTC，所述发夹探针H1的序列为SEQ ID No.3所示序列CCCAACCCGAATTGAACTATrAGGAAGAGGGTAGGGCGGGTT GGG；该方法基于汞离子介导的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶配对原理T-Hg²⁺-T，所述辅助探针P的胸腺嘧啶借助缓冲溶液中的汞离子与所述发夹探针H0的胸腺嘧啶形成配对，从而诱发形成两个独立的脱氧核酶DNAzyme，在辅助因子镁离子Mg²⁺作用下两个脱氧核酶DNAzyme循环催化裂解修饰有核糖核苷酸rA位点的发夹探针H1，释放出的富含鸟嘌呤G的脱氧核糖核酸序列在氯化血红素hemin和钾离子的存在下，形成G-四链体DNA酶，该G-四链体DNA酶催化H₂O₂介导的生色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB生成蓝色产物，经H₂SO₄终止形成稳定的黄色溶液，紫外分光光度计测定450 nm处的吸光度。

2.根据权利要求1所述的汞离子检测方法，还包括如下步骤：

（1）所述辅助探针P与所述发夹探针H0和H1分别退火处理；

（2）待测样本加入经步骤（1）处理的辅助探针P、所述发夹探针H0和H1；

（3）将所述氯化血红素、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢加入反应溶液；

（4）加入所述终止液，紫外分光光度计测定450 nm的吸光度。

3.根据权利要求2所述的汞离子检测方法，其特征在于所述退火处理为95 ℃水浴下5min，缓慢冷却至室温。

4.根据权利要求1~3任一项所述汞离子检测方法，其特征在于所述辅助探针P和发夹探针H0浓度均为20 nM，所述发夹探针H1浓度为10 nM~100 nM，所述氯化血红素的浓度为50~300 nM，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢浓度分别为0.025%和0.03%，所述终止液浓度为2 M。

5.一种用于权利要求1所述汞离子检测方法的汞离子检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的汞离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一容器，所述第一容器内含有所述辅助探针P；

所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内含有所述发夹探针H0；

所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内含有所述发夹探针H1；

所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内含有所述氯化血红素；

所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内含有所述生色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢；

所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内含有所述终止液H₂SO₄。

7.一种汞离子检测试剂盒的使用方法，其特征包括权利要求6所述的汞离子检测试剂盒，还包括如下步骤：

（1）取第一、第二和第三容器溶液各10 μL加入待测溶液中，室温反应100 min；

（2）加入所述第四容器的溶液80 μL，室温反应30 min；

（3）加入所述第五容器中的溶液30 μL，室温反应30 min；

（4）最后加入所述第六容器的溶液50 μL，紫外分光光度计测定450 nm处的吸光度。