[发明专利]一种模拟酶辅助的汞离子检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种利用双脱氧核酶(DNAzyme)辅助放大产生信号的汞离子检测方法及试剂盒，该检测方法包括辅助探针P，发夹探针H0，发夹探针H1，其中辅助探针P和发夹探针H0在汞离子存在时结合形成两个独立的DNAzyme，催化裂解修饰核糖核酸苷酶(rA)的发夹探针H1，释放出大量富含鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核酸序列。在氯化血红素(hemin)和钾离子溶液中，释放出的序列形成G‑四链体DNA酶催化H₂O₂介导的生色底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色，经H₂SO₄终止形成稳定的黄色溶液。本发明用于饮用水中汞离子的检测，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单等特点，在实际样品检测中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种汞离子检测方法及试剂盒。

背景技术

水溶性汞离子是常见的一种无机形式的汞污染，低浓度下也会对人体健康和环境造成严重危害。例如，摄入体内的汞离子不断累积从而损伤DNA、抑制配体-受体相互作用、破坏免疫系统等，造成脑损伤、肾衰竭、各种认知和运动障碍等许多严重的健康问题，严重者会发生肢体形变，呼吸困难甚至死亡。因此，汞离子的检测对于应对环境和健康问题至关重要。

目前，包括原子荧光光谱法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法等广泛应用于汞离子的检测。虽然这些方法具有较好的灵敏度和选择性成为汞离子检测的标准方法，但由于存在仪器昂贵、携带不便、操作复杂、对使用人员的专业性要求高等问题，在应对现场检测仍然面临困难。设计一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低的汞离子检测方法仍然是迫切的现实需求。

发明内容

本发明目的在于解决现有检测过种中面临的问题，开发一种可适应于现场检测的痕量汞离子检测方法。该方法基于汞离子介导的胸腺嘧啶和胸腺嘧啶配对原理(T-Hg²⁺-T)，辅助探针P的胸腺嘧啶借助缓冲溶液中的汞离子与发夹探针H0的胸腺嘧啶形成配对，从而诱发形成两个独立的脱氧核酶(DNAzyme)，在辅助因子镁离子(Mg²⁺)作用下两个模拟酶循环催化裂解修饰有核糖核苷酸(rA)位点的发夹探针H1，释放出的富含鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核酸序列在氯化血红素(hemin)和钾离子的存在下，形成G-四链体DNA酶。该G-四链体DNA酶催化H₂O₂介导的生色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色产物，经H₂SO₄终止形成稳定的黄色溶液。紫外分光光度计测定450nm处的吸光度。

上述的缓冲溶液，所用的Tris-HCl缓冲液浓度为20mM(20mM三羟甲基氨基甲烷，100mM NaCl，20mM KCl，10mM MgCl₂，1M HCl调节溶液pH值7.4)；HEPES缓冲液浓度为25mMHEPES(25mM 4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸，200mM NaCl，20mM KCl，0.05％Triton X-100，1％DMSO，pH＝7.4)；

上述的辅助探针P、发夹探针H0存在胸腺嘧啶错配的序列结构，发夹探针H1环部修饰有核糖核酸苷酶(rA)的裂解位点、茎部设计一段富含鸟嘌呤的序列；所述辅助探针P的序列为表一SEQ ID No.1所示的序列，所述发夹探针H0的序列为表一SEQ ID No.2所示的序列，所述发夹探针H1的序列为表一SEQ ID No.3所示的序列。

上述的检测方法，优选的，所述辅助探针P浓度为20nM。

上述的检测方法，优选的，所述发夹探针H0浓度为20nM。

上述的检测方法，优选的，所述发夹探针H1浓度为10、20、40、60、80、100nM；进一步优选的所述发夹探针H1浓度为60nM。