[发明专利]一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法

权利要求书

1.一种基于监测活细胞中Cyt c进行可视化评估呕吐毒素细胞毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：

1)利用Cyt c作为模板分子对CdTe量子点进行分子印迹修饰，获得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP；然后将活细胞接种于含CdTe@MIP的培养基中进行共孵育，所述含CdTe@MIP的培养基中CdTe@MIP的浓度为350-450μg/mL；孵育10-15h后，除去含CdTe@MIP的培养基、并分别替换为含有一系列已知浓度的DON的培养基继续孵育；孵育结束后，除去含有DON的培养基，清洗、染色，再保持在基本培养基中进行荧光成像，获得不同浓度DON相应的激光共聚焦成像图，得到共聚焦图片相应的像素强度A；以无DON刺激时所得共聚焦图片的像素强度为A₀，获得共聚焦图片相应的相对像素强度A/A₀；

2)对步骤1)中在含有一系列已知浓度的DON的培养基孵育后的细胞进行毒性检测，获得相应的细胞存活率或者细胞凋亡率；

3)利用步骤1)中不同浓度对应的激光共聚焦成像图的相对像素强度A/A₀与步骤2)中获得的细胞存活率或者细胞凋亡率进行关联，构建呕吐毒素细胞毒性评估模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子印迹修饰的过程包括：

(1)以Cyt c作为模板分子，与CdTe量子点、APTES分散于水中，在室温下混匀反应；

(2)然后加入TEOS和NH₃·H₂O，继续在室温下混匀反应；

(3)反应结束后，固液分离、收集固体、洗涤，即得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，利用CCK-8细胞活性试剂盒对在含有DON的培养基孵育后的细胞进行毒性检测，获得相应的细胞存活率；利用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒对在含有DON的培养基孵育后的细胞进行细胞凋亡检测，获得相应的细胞凋亡率。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

当相对像素强度A/A₀为0.5～0.84时，相应的细胞存活率不超过89％±3％；当相对像素强度A/A₀为0.35～0.5时，细胞存活率不超过82％±3％；当相对像素强度A/A₀为0.13～0.35时，细胞存活率不超过71％±3％；当相对像素强度A/A₀为0.06～0.13时，细胞存活率不超过68％±2％；当相对像素强度A/A₀为不超过0.06时，细胞存活率不超过63％±1％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

当相对像素强度A/A₀为0.5～0.84时，相应的细胞凋亡率不低于5％±0.4％；当相对像素强度A/A₀为0.35～0.5时，细胞凋亡率不低于7％±0.8％；当相对像素强度A/A₀为0.13～0.35时，细胞凋亡率不低于10％±0.6％；当相对像素强度A/A₀为0.06～0.13时，细胞凋亡率不低于13％±0.8％；当相对像素强度A/A₀不超过0.06时，细胞凋亡率不低于22％±2.0％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

利用相对像素强度与细胞存活率构建线性模型：y＝36.02x+61.69，其中，x为相对像素强度，y为细胞存活率；线性模型的R2＝0.9663，线性范围为0.06x1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述呕吐毒素细胞毒性评估模型为：

利用相对像素强度与细胞凋亡率构建线性模型：y＝-11.834x+14.191，其中，x为相对像素强度，y为细胞凋亡率；线性模型的R²＝0.9456，线性范围为0.13x0.84。