[发明专利]一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法

说明书

本发明公开了一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法，属于荧光成像及生物传感技术领域。本发明方法利用能特异性识别Cyt c的无标记荧光材料CdTe@MIP作为探针，结合了MIP识别的高选择性和荧光检测的高灵敏度，黄色发光性能，实现细胞中Cyt c的荧光成像。本发明方法中，当HepG2细胞被DON诱导至凋亡时，线粒体产生的Cyt c释放至细胞质，利用激光共聚焦显微镜的成像结果，实现对活细胞内Cyt c的可视化实时监测、以及可视化评估DON诱导的细胞凋亡水平，丰富了DON毒性的评估手段，为食品安全提供了早期预警手段。

技术领域

本发明属于荧光成像及生物传感技术领域，具体涉及一种可视化监测活细胞中细胞色素c和评估呕吐毒素细胞毒性的方法。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，也称为呕吐毒素)是常见的单端孢霉烯族B型毒素，它作为污染源出现在粮食谷物和其加工食品中，损害胃肠道系统，生殖系统，神经内分泌系统和免疫系统。DON的毒理学研究表明，线粒体信号通路的激活是DON诱导的免疫毒性的机制之一，在该过程中，线粒体通透性转换孔打开，线粒体膜电位降低，受损的线粒体将细胞色素c(Cyt c)释放到细胞质中，激活caspase 9和caspase 3而致使细胞凋亡。Cyt c是一种生物标志物，可导致线粒体不可逆转的功能障碍和胱天蛋白酶的快速活化，常作为细胞凋亡中的无回归点。目前对Cyt c进行检测的方法主要有流式细胞术，蛋白质印迹分析，高效液相色谱和酶联免疫吸附测定等，这些典型的检测技术已用于常规的基础生化研究，但是实验过程中繁杂的靶标提取程序限制了活细胞的实时监测。基于Cyt c作为DON毒性通路中的关键因素，开发一种有效监测Cyt c的方法以更好地了解DON毒理作用并进一步控制其风险具有重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明开发了一种成本较低的分子印迹荧光探针、结合荧光成像技术，应用于在细胞中监测线粒体释出的Cyt c以评估DON的细胞毒性的方法，该方法具有合成路线简单、成本较低、选择性好、灵敏度高、生物相容性高等优点。

在本发明方法中，荧光成像技术可实现活细胞中生物标志物的可视化，由于其高灵敏度，低成本，低放射性，原位和实时检测以及在生物环境中的良好表现，该技术的采用将实现实时追踪活细胞中的Cyt c，为评估DON的细胞毒性更好地提供实时信息。

分子印迹聚合物(MIP)在高度交联的3D聚合物基质中形成与模板分子相同形状，大小和官能团功能的空穴，MIP修饰的荧光探针结合了MIP识别的优异的选择性和荧光检测的高灵敏度的优点而备受关注，近年来开发了大量的荧光型分子印迹材料在胞外检测相应的靶标，但结合MIP和荧光成像技术可视化监测Cyt c水平以评估DON毒性的方法还未见报道。

本发明第一个目的是提供一种可视化监测活细胞中Cyt c的方法，所述方法包括如下过程：

利用Cyt c作为模板分子对CdTe量子点进行分子印迹修饰，获得荧光型Cyt c分子印迹材料CdTe@MIP；然后将活细胞接种于含CdTe@MIP的培养基中进行孵育；孵育结束后，除去含CdTe@MIP的培养基、并进行染色，再保持在基本培养基中进行荧光成像。

在本发明的一种实施方式中，所述含CdTe@MIP的培养基中CdTe@MIP的浓度为350-450μg/mL；可具体选择400μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述孵育的时间为10-15h；可具体选择12h。

在本发明的一种实施方式中，所述分子印迹修饰的过程包括：

(1)以Cyt c作为模板分子，与CdTe量子点、APTES分散于水中，在室温下反应30min；其中，Cyt c：APTES物质的量比为1：4；

(2)依次加入TEOS和NH₃·H₂O，继续在室温下反应12h；其中，Cyt c：TEOS物质的量比为1：20；