[发明专利]一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其应用

说明书

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种新型CRISPR‑Cas9系统载体及其应用。本发明实施例提供的载体上依次包括下述功能元件：上游LoxP序列、sgRNA序列、Cas9蛋白、可诱导启动子、Cre重组酶、同向下游LoxP序列；其中，sgRNA序列和Cas9蛋白顺序可互换；sgRNA序列靶向目的基因。本发明提供的载体，将CRISPR‑Cas9系统与Cre‑Loxp系统结合，充分发挥两套系统的基因敲除功能，将上游LoxP序列设置在CRISPR‑Cas9系统前；在CRISPR‑Cas9系统后依次设置可诱导启动子、Cre重组酶和下游同向LoxP序列；在CRISPR‑Cas9系统完成基因敲除或者基因敲入功能后，对可诱导启动子进行诱导，开始表达Cre重组酶，Cre‑Loxp系统启动，将上游LoxP序列和下游同向LoxP序列之间的功能元件敲除，彻底避免Cre‑Loxp系统和CRISPR‑Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas9(规律成簇间隔短回文重复系统)技术是一种新型基因编辑方法，可用于基因的定点敲除，在基因治疗领域广受关注。Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸(guideRNA，sgRNA)引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组来产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。

目前有很多研究者使用CRISPR-Cas9体系敲除致病基因或者敲入有益基因进行疾病预防或者治疗，但是没有考虑基因敲除或者敲入后，CRISPR-Cas9体系可能对细胞的潜在危险：首先，Cas9蛋白作为外源蛋白，可能引起机体内的免疫反应；其次，sgRNA在细胞内作为外源核酸也有可能引起免疫反应；再次，Cas9蛋白和sgRNA同时存在，还有可能造成对细胞基因组的过度剪切。

虽然现在有案例使用RNA转染技术，直接将sgRNA和Cas9 mRNA共同转染到需要改造的细胞中，进行瞬时表达，但是这些技术较多用于体外实验，不适用于体内实验或者体内基因编辑治疗。

Cre-loxP是一种位点特异的基因重组技术。Cre蛋白(CyclizationRecombination Enzyme)是一种重组酶，由343个氨基酸组成。LoxP位点(locus of X-overP1)是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定loxP的方向。Cre重组酶能识别LoxP位点，使两个LoxP位点间发生基因重组。Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA，但Cre重组酶同样可能会引起体内的免疫反应。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新型CRISPR-Cas9系统载体及其应用。本发明将CRISPR-Cas9系统与Cre-Loxp系统结合，充分发挥两套系统的基因敲除功能，将上游LoxP序列设置在CRISPR-Cas9系统前；在CRISPR-Cas9系统后依次设置可诱导启动子、Cre重组酶和下游同向LoxP序列；在CRISPR-Cas9系统完成基因敲除或者基因敲入功能后，对可诱导启动子进行诱导，开始表达Cre重组酶，Cre-Loxp系统启动，将上游LoxP序列和下游同向LoxP序列之间的功能元件敲除，彻底避免Cre-Loxp系统和CRISPR-Cas9系统过度剪切细胞基因组或引起免疫反应。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种载体，所述载体上依次包括下述功能元件：