[发明专利]一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法

权利要求书

1.一种去除高丰度RNA的测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取样品中的总RNA，将所有RNA连接3’接头；所述3’接头的核苷酸序列为：5’-rApp/NNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3’（SEQ ID NO.1）；

（2）将连接有3’接头的RNA进行片段化处理；

（3）将片段化处理后的RNA连接5’接头；所述5’接头的核苷酸序列为：

5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN-3’（SEQ ID NO.2）；

（4）设计DNA探针，并与高丰度RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂交链；部分探针序列如SEQID NO .3-SEQ ID NO .32所示；

（5）用RNaseH切割DNA：RNA杂交链，使高丰度RNA断开与3’接头的连接；

（6）经反转录和PCR扩增，得到去除高丰度RNA的测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述片段化处理的方法为碱水解。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中连接5’接头前，采用T4多聚核苷酸激酶对片段化后的RNA的5’末端进行磷酸化修饰，以便发生连接反应。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中DNA探针的长度为20-30nt。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（6）中反转录所用引物的核苷酸序列为：

5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（SEQ ID NO.33）。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（6）中PCR扩增所用引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’（SEQ IDNO.34）；

下游引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（SEQ ID NO.35）。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）连接3’接头后和/或步骤（3）连接5’接头后，进行RNA纯化并去除多余接头。

8.一种去除高丰度RNA的测序文库，其特征在于，由权利要求1-7中任一项所述的构建方法制得。