[发明专利]一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法

说明书

本发明属于高通量测序技术领域，公开了一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法。所述构建方法包括以下步骤：(1)提取样品中的总RNA，将所有RNA连接3’接头；(2)RNA片段化处理；(3)RNA连接5’接头；(4)设计DNA探针，并与高丰度RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂交链；(5)切割DNA：RNA杂交链，使高丰度RNA断开与3’接头的连接；(6)经反转录和PCR扩增，得到去除高丰度RNA的测序文库。该构建方法能够去除高通量测序文库中高丰度RNA，大大降低高丰度RNA的比例，并具有实验步骤简单、成本低、效果好的优势，可提升大规模RNA平行测序文库的质量，节约成本。

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法。

背景技术

相对于Sanger测序法(双脱氧终止法)每次只能确定几个至数百个脱氧核糖核酸(DNA)分子的序列，新一代高通量测序技术每次能够检测数以百万计的DNA序列，该方法以高通量方法在异质性DNA片段上连接测序接头(高通量DNA文库构建)，以生化反应结合影像技术对DNA标签进行序列测定。DNA文库主要来源于两个：1)在短的基因组DNA片段两边直接加测序接头；2)RNA片段化之后需反转录成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转录成cDNA，然后再片段化并加上接头。而RNA平行测序所采用的方法主要为后者，构建标签库时所用RNA的来源多样，如mRNA、新生链RNA、ncRNA、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和siRNA等。

如今，科学界已越来越多地应用大规模高通量测序技术来研究生物学问题，如：1)在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(De novo sequencing)，获得该物种的基因组参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；2)对已有基因组参考序列的物种，进行全基因组重测序(Resequencing)，在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现不同品种和个体差异的分子基础，进而为物种进化规律提供重要的证据和参考依据；3)与染色质免疫共沉淀(ChIP)和表观遗传标记免疫共沉淀技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组和组蛋白上的表观遗传位点；4)在转录组水平上进行全转录组测序(Whole transcriptome sequencing)，可以开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究；5)进行小分子RNA测序(Small RNA sequencing)，通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子等；6)进行新生链RNA测序，通过多种方法提取RNA聚合酶II(Pol II)转录产生的新生链RNA，用于构建标签库，可以分析细胞在不同生长发育阶段和环境条件下Pol II实时转录动态变化过程。

要想研究以上和RNA组学相关的生物学问题，最基础和重要的是构建高质量的RNA标签库，用于高通量测序得到RNA序列。然而细胞总RNA中含有各种不同的RNA，特别是大量非编码/高丰度的RNA。如核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、细胞核小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)和小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)等。RNA聚合酶I(Pol I)转录rRNA的前体：5.8S、18S和28S rRNA，上述RNA约占细胞总RNA的75％；而RNA聚合酶II(Pol II)转录产生mRNA、大部分snRNA及一些参与调控的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，mRNA只占细胞质RNA的2-5％；而RNA聚合酶III(Pol III)转录的tRNA、5S rRNA和其它一些小RNA，如snRNA和snoRNA，它们约占细胞质RNA的25％；此外，植物细胞还有两类特有的RNA聚合酶：Pol IV和Pol V，转录加工产生siRNA。虽然这些非编码RNA没有起到蛋白质基因功能的作用，然而在很多的生物学过程中起到了至关重要的功能，如siRNA在RNA介导DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)的途径中起作用，miRNA在细胞生长发育中有重要的功能。