[发明专利]一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物及方法

权利要求书

1.一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物，其特征是：包括一对正向引物和反向引物和混合探针组；同时检测野生型突变、突变型I和突变型II三种突变基因型。

2.如权利要求1所述应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物，其特征是所述引物对具体如下：

正向引物: EGFR p.L858R-F 5'-ACACCGCAGCATGTCAAGA-3'；

反向引物: EGFR p.L858R-R 5'-TGGTATTCTTTCTCTTCCGCA-3'。

3.如权利要求1所述应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物，其特征是：所述混合探针组包括为野生型探针、突变型I探针和突变型II探针；具体为：

野生型探针EGFR p.L858R-P-YS ATTTTGGGCTGGCC-5’HEX-3’MGB；

突变型I探针EGFR p.L858R c.2573TG-P-G ATTTTGGGCGGGCC-5’FAM-3’MGB；

突变型II探针EGFR p.L858R c.2573_2574TGGT-P-GT AGATTTTGGGCGTGCC-5’FAM-3’MGB和-5’HEX-3’MGB。

4.如权利要求1所述应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物，其特征是：所述野生型序列如SEQ ID No.6所示；突变型I序列如SEQ ID No.7所示；突变型II序列如SEQ ID No.8所示。

5.一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物，其特征是：应用于数字PCR检测肺癌患者血液或者癌症组织中EGFR L858R突变。

6.一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的方法，其特征是步骤如下：

（1）使用商业化试剂盒提取肿瘤组织或者肿瘤患者血液中的基因组；

（2）按照如下体系配置ddPCR检测用组分：

（3）将微滴生成卡放入微滴生成卡卡座，向中间一排细孔中每孔加入20μL反应体系；按照模板浓度从低到高的顺序加入；将BioRad探针法微滴生成油70μL每孔加入生成卡最下面一排；在卡座上装好密封垫后，放入微滴生成仪；微滴生成结束后，缓慢从最上面一排孔中吸出微滴转移到八连管中；

（4）进行PCR热循环，具体如下：首先在95℃加热10min；随后在95℃加热30s，68℃加热1min，重复进行上述加热40个循环；98℃加热10min；最后在12℃保温，结束程序；PCR仪升降温速率均为2℃/s；

（5）使用微滴读数仪读数并分析结果，最终得到模板浓度。

7.根据权利要求6所述应用数字PCR检测EGFR L858R突变的方法，其特征是：步骤（2）中保存在-20℃的组分融化后需要在瞬时离心涡旋混匀；按照从上至下的顺序分别加入各组分后，涡旋混匀待用。