[发明专利]一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物及方法

说明书

一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物及方法，属于肺癌检测技术领域。本发明采用的引物组包括一对正向引物和反向引物和混合探针组；其能够采用Bio‑Rad Qx200微滴式数字PCR系统同时检测野生型突变、突变型I和突变型II三种突变基因型。本发明采用QX200微滴式数字PCR分析系统对EGFR L858R野生型基因以及两种突变进行检测，采用本发明所述引物对和混合探针，能够同时检测野生型、突变I和突变II三种不同基因型，克服了该系统只有FAM、HEX两个通道，采用常规手段只能检测两种基因的问题，简化了流程，降低了成本，具有极强的实用价值。

技术领域

本发明涉及一种应用数字PCR检测EGFR L858R突变的引物及方法，具体涉及一种应用数字PCR检测肺癌患者血液或者癌症组织中EGFR L858R突变的方法，属于肺癌检测技术领域。

背景技术

分子诊断是将分子生物学技术应用于疾病诊断的医学分支学科，利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。精准医疗的发展，将持续推动分子诊断的进步。目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术：荧光定量PCR技术（qPCR）、高通量测序技术（NGS）和数字PCR。

qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。每扩增一条DNA链，就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放，实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步，可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，获得待测样品模板的初始浓度。但是，qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到精准绝对定量。

NGS可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在基因组水平上，NGS可进行从头测序而获得该物种的全长序列，为后续研究奠定基础；对已知参考序列的物种，进行全基因组重测序可检测新的突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上，NGS可进行全转录组测序，开展可变剪接、基因表达差异、新非编码RNA分子发现等研究。NGS与染色质免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合，可检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。NGS功能强大，适合用于探索筛选新的生物标志物，但是实验操作较复杂，数据分析难度较大，检测周期长，成本较高。

NGS在测序过程中，由于试剂差异、人员操作、仪器维护等因素，实际的捕获效率和覆盖度会与期望值存在偏差，可能会捕获到非目标区域序列，也可能漏捕目标区域序列。非目标区域序列对于靶向测序没有意义，而脱靶序列会导致测序信息缺失。因此，对于任何检测项目，每一次测序必须给出靶向区域的覆盖度统计，这是衡量测序质量的重要指标之一。当覆盖度过低时，则需补测数据或对样本重测，同时对可疑数据用数字PCR等方法进行验证。

数字PCR是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数，实现起始样品中核酸分子的绝对定量，且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域，如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面，在已知突变的癌症分子标志物的检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。

与常规PCR方法相比，数字PCR有如下优势：

1.能够绝对定量：常规PCR定量需要制定已知拷贝数的标准DNA曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在统一体系，条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异从而影响定量结果的准确性。而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝对定量。

2.样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。

3.灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本。且能避免非同源异质双链的形成。