[发明专利]一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用

权利要求书

1.抑制ELISA试剂在制备用于检测口蹄疫病毒抗体的试剂盒中的应用，其特征在于：在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清和阴阳性对照血清进行系列稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，在所述ELISA板上设置至少4孔病毒抗原对照；孵育洗涤后加入检测性抗体；孵育后加入酶标抗体，TMB底物显色终止后450nm波长读取OD值；

所述口蹄疫型特异抗体为兔抗口蹄疫病毒血清；所述检测性抗体为豚鼠抗口蹄疫病毒血清；

所述抑制ELISA方法，包括以下步骤：

步骤一、包被ELISA板：用pH值9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将兔抗口蹄疫病毒血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存；

步骤二、血清稀释及抗原反应：在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阳性对照血清、阴性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，每块ELISA板均设置至少4孔病毒抗原对照；ELISA板的反应孔内均为200µl/孔，封板，震荡， 37℃孵育30分钟；

步骤三、将经步骤二反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗口蹄疫病毒血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟；

步骤四、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟；所述酶标抗体为兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物；

步骤五、将经步骤四反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl浓度为1.25M的H₂SO₄终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；

步骤六：结果判定：以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阳性对照血清、阴性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔中OD值略高于临界值与略低于临界值的相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价＞90判为口蹄疫抗体阳性；

以上步骤中，所述兔抗口蹄疫病毒血清的工作浓度、豚鼠抗口蹄疫病毒血清和酶标抗体的工作浓度均为1:1000，所述病毒抗原对照4孔的OD值不小于1.0。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述病毒抗原为O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原或A型FMDV抗原。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述病毒抗原是经口蹄疫病毒灭活得到或经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到。