[发明专利]一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用

说明书

本发明涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用，属于生物技术技术领域，本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入等量的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体抑制病毒抗原与ELISA板上的捕获抗体结合，判定参照液相阻断ELISA方法，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%抑制的临界值，成功地建立起了抑制ELISA方法，可用于检测口蹄疫抗体。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的新方法，特别涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用。

背景技术

口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Virus, FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病，被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征，该病传播途径多、速度快，每次爆发均会给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O、A和亚洲1型口蹄疫病毒进行疫苗接种。

口蹄疫血清型特异性抗体检测是疫苗免疫效果评估及流行病学调查采用的主要血清学调查手段之一。液相阻断ELISA方法检测口蹄疫抗体是世界动物卫生组织指定的参考方法，固相竞争ELISA方法在口蹄疫抗体检测上敏感性和特异性均与之接近，所用到的关键试剂及操作程序相似；基于单克隆抗体发展起来的抗体阻断ELISA方法，操作简便、省时，具有较高的特异性。口蹄疫疫苗免疫动物抗体检测是我国每年口蹄疫防疫程序中要求必检的内容。

目前，液相阻断ELISA方法是农业部指定口蹄疫免疫抗体检测方法，被全国各级兽医诊断实验室广泛采用，由于该方法操作步骤繁琐、用时长，容易造成操作失误，给该方法的进一步推广应用带来了一定的技术障碍。固相竞争ELISA方法由于其在在方法和步骤及检测时间上与液相阻断ELISA方法接近，更由于其在猪的血清抗体检测上敏感性较低，所以一直也没有得到广泛应用。虽然抗体阻断ELISA方法检测口蹄疫抗体的敏感性和特异性不如液相阻断ELISA方法，但由于其操作步骤简便、用时短，越来越多的被用于口蹄疫抗体的检测。

口蹄疫病毒包括完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白（12S），146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分。纯化146S抗原免疫实验动物制备的抗血清常被用作试剂材料，是液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接夹心ELISA共同采用的技术方案。单克隆抗体阻断ELISA所用的捕获抗原是口蹄疫VP1 基因的表达蛋白，由于口蹄疫病毒基因不同亚型之间的变异比较大，降低了该方法检测的敏感性。

如何对现有方法进行优化创新，是建立口蹄疫抗体检测新方法需要解决的一个关键问题。

发明内容

为了解决如何对现有方法进行优化创新以建立口蹄疫抗体检测新方法的问题，本发明的目的一在于提供一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法，目的二在于提供基于所述抑制ELISA方法的检测试剂盒，目的三在于提供所述抑制ELISA在口蹄疫病毒抗体检测方面的应用。本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入等量的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体抑制病毒抗原与ELISA板上的捕获抗体结合，判定参照液相阻断ELISA方法，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%抑制的临界值，成功地建立起了抑制ELISA方法，可用于检测口蹄疫抗体。