[发明专利]利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用

权利要求书

1.一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将预处理后的干细胞培养液加入蛋白交联纳米亲和微球，再加入亲和液，反应1h-5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液；

所述亲和液为以下组分：15mM-25mM HEPES、20mM-30mM CaCl₂、1mM-5mM NaCl、1mM-5mM_、MgCl₂，pH7.2-7.5；

所述洗涤液为以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、5mM-15mM NaCl、1mM-5mM CaCl₂、1mM-5mM MgCl₂、pH7.2-7.5；

所述洗脱液为以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、1mM-5mM NaCl、5mM-10m MEDTA、pH7.2-7.5；

所述蛋白交联纳米亲和微球的制备方法为：

将生物素标记的Reprotide^TM511蛋白或Tim4蛋白加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球中，反应30 min-3 h后，离心得沉淀，所述沉淀即为蛋白交联纳米亲和微球。

2.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，

所述的干细胞外泌体为不同来源的干细胞及其诱导分化细胞，包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞，羊膜间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞及其诱导分化细胞的外泌体。

3.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，

所述生物素标记的Reprotide^TM511蛋白或Tim4蛋白的制备方法为：

将Reprotide^TM511蛋白或Tim4蛋白加入活性生物素，4℃孵育1h-24h，再用脱盐柱去除游离的生物素，用 PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的Reprotide^TM511蛋白或Tim4蛋白。

4.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，

所述预处理的方法为：取干细胞培养上清至于离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。

5.如权利要求1所述的利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，其特征在于，

所述干细胞置于干细胞培养基中培养条件，含5％CO₂、温度为37℃，待细胞贴壁铺满85%-95%时，收集上清液。