[发明专利]利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体的方法及应用，所述方法包括：将预处理后的干细胞培养液加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，再加入亲和液，反应1h‑5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物洗涤后，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液。本发明的蛋白交联纳米亲和微球对各种干细胞来源的外泌体提取纯化，该方法操作方便，耗时短，提取效率高，获得的外泌体纯度高，产量多，还能保证其生物学活性及完整性。该方法制备的干细胞外泌体用于外泌体相关的技术开发及转化应用，包括外泌体载药、外泌体靶向治疗(包括急性呼吸窘迫症，呼吸道感染，哮喘及阿默茨海默症等)，及创面修复及医学美容类应用等。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用蛋白交联纳米亲和微球纯化干细胞外泌体制备方法及应用。

背景技术

外泌体是由活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150 nm，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液、腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。

目前，针对外泌体的提取纯化没有一个统一的标准，常用的方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工、回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐、重复性差、耗时很长、回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。

综上所述，亟需一种操作方便，提取效率高，获得的外泌体纯度高，可以适合各种样本来源的外泌体提取方法。

发明内容

为此，本发明提供一种蛋白交联纳米亲和微球及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供一种利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法，所述方法包括：

将预处理后的干细胞培养液加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球，再加入亲和液，反应1h-5h后离心分离，得到沉淀物，将所述沉淀物用洗涤液洗涤，最后加入洗脱液洗脱，离心得到含干细胞外泌体的上清液。

优选的，所述的干细胞外泌体为不同来源的干细胞及其诱导分化细胞，包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞，羊膜间充质干细胞、牙髓干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞及其诱导分化细胞的外泌体。

优选的，所述亲和液包括以下组分：15mM-25mM HEPES、20mM-30mM CaCl₂、1mM-5mMNaCl、1mM-5mM_、MgCl₂，pH（7.2-7.5）。

优选的，所述洗涤液包括以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、5mM-15mM NaCl、1mM-5mM CaCl₂、1mM-5mM MgCl₂、pH7.2-7.5。

优选的，所述洗脱液包括以下组分：20mM-30mM Tris-HCl、1mM-5mM NaCl、5mM-10mMEDTA、pH7.2-7.5。

优选的，所述蛋白交联纳米亲和微球的制备方法为：