[发明专利]一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法

权利要求书

1.一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀；所述支气管肺泡灌洗液的来源为患弥漫性肺泡沉积疾病的病人中收集得到；

2)将所述沉淀重悬，得到细胞悬液；所述重悬用溶液为含体积百分含量1.5％～2.5％的FBS、pH值7.4的PBS缓冲液；

3)将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞；所述Percoll非连续性密度梯度离心的转速为800×g～1600×g；所述Percoll非连续性密度梯度离心的时间为15～20min，升速为3～6×g，降速为0～2×g；

所述Percoll的分层液为由体积百分含量30％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系1或由体积百分含量40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系2。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述去除杂质的方法包括采用4～5层纱布过滤；

所述固液分离的方法包括离心；所述离心的转速为300×g～500×g；所述离心的时间为5～10min。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述弥漫性肺泡沉积疾病包括肺泡蛋白沉积症、肺泡微结石症和早期尘肺。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，患所述肺泡蛋白沉积症病人中收集的肺泡灌洗液中，沉积蛋白的含量为50％～70％。

5.根据权利要求1～4任意一项所述方法，其特征在于，得到所述细胞层后，还包括去除红细胞、去除死细胞和台盼蓝染色；

所述去除死细胞的方法采用Dead Cell Removal Kit进行去除。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述去除红细胞包括所述细胞层去除红细胞、离心和清洗；

所述去除红细胞的方法为将所述细胞层离心去上清，加入裂红液，离心去上清，直至得到的细胞团用肉眼观察无红色出现结束。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述台盼蓝染色判读透亮细胞未着色为活细胞，明确细胞活率；

所述活细胞包括上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。