[发明专利]一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，属于细胞提取技术领域。从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀重悬，将细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层。本发明提供的方法能够高效去除肺泡灌洗液中细胞成分、细胞碎片成分以及沉积在肺泡部的粉尘、药物、表面活性物质和分泌物等杂质，较大程度分离获得具有诊断意义的细胞成分，用于疾病的临床诊断及基础研究。

技术领域

本发明属于细胞提取技术领域，具体涉及一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法。

背景技术

肺泡微环境是反映肺泡功能状态的重要部分，组成肺泡结构的上皮细胞及肺泡腔内的免疫细胞，共同形成了天然免疫的屏障，接受着吸入气体中有害物质的冲击，保护机体内环境的稳定。支气管肺泡灌洗通过纤支镜将特定量的生理盐水灌入某一叶/段肺，通过负压或重力回收液体，当中带有肺泡腔内的细胞，通过对细胞的形态、功能或表型进行评价，完成细胞学的判读，从而为疾病的诊断提供数据。细胞学证据不仅有利于诊断，大剂量的灌洗清除细胞也是重要的治疗手段。因此，分离复杂的肺泡灌洗液中的细胞对于疾病的诊断和治疗有着非常重大的意义。

现有技术中，分离肺泡灌洗液细胞直接用等渗缓冲液结合低速离心法进行分离，一般是PBS或生理盐水离心，但是会混有很多杂质，包括菌丝、痰液之类，该种方法制备的细胞仅仅用于分析，无法进行后续培养。

然而从肺部感染疾病和弥漫性肺泡沉积疾病如肺泡蛋白沉积症和早期尘肺的病人中分离的灌洗液成分非常复杂，因为除了细胞成分及细胞碎片外，还包括沉积在肺泡内的粉尘、药物、表面活性物质、分泌物和坏死物等，这些杂质直接覆盖或粘附在细胞上，影响细胞的分离。因此，如何高效分离出细胞成分一直是本领域技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，分离得到具有诊断和治疗的细胞成分。

本发明提供了一种从支气管肺泡灌洗液中分离提取细胞的方法，包括以下步骤：

1)将肺泡灌洗液去除杂质后固液分离，收集沉淀；

2)将所述沉淀重悬，得到细胞悬液；

3)将所述细胞悬液经Percoll非连续性密度梯度离心，收集Percoll分层液之间的细胞层，经清洗离心后得到细胞。

优选的，步骤2)中所述重悬用溶液为含体积百分含量1.5％～2.5％的FBS、pH值7.4的PBS缓冲液。

优选的，步骤3)中所述Percoll非连续性密度梯度离心的转速为800×g～1600×g；所述Percoll非连续性密度梯度离心的时间为15～20min，升速为3～6×g，降速为0～2×g。

优选的，步骤3)中所述Percoll非连续性密度梯度离心时，Percoll的分层液为由体积百分含量30％～40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％～80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系；

优选的，包括由体积百分含量30％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量60％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系1或由体积百分含量40％的Percoll的PBS缓冲液和体积百分含量80％的Percoll的PBS缓冲液组成的体系2。

优选的，步骤1)中所述去除杂质的方法包括采用4～5层纱布过滤；

所述固液分离的方法包括离心；所述离心的转速为300×g～500×g；所述离心的时间为5～10min。

优选的，所述肺泡灌洗液来源为患弥漫性肺泡沉积疾病的病人中收集得到；

优选的，所述弥漫性肺泡沉积疾病包括肺泡蛋白沉积症、肺泡微结石症和早期尘肺。