[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法，其特征在于，基于CRISPR-Cas系统，通过随机gRNA文库的引导，对生命体的全基因组进行散弹式随机切割，在非保真式DNA修补作用下，引发全基因组尺度上的随机突变。

2.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述随机gRNA文库是一种以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，经PCR扩增获得的gRNA表达框文库，其中20个连续简并性碱基的区域对应于gRNA识别靶序列区域。

3.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述非保真式DNA修补是指不依赖于外源同源重组片段的宿主本身基因组修补机制。

4.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述gRNA表达框文库包括启动子、20个连续简并性碱基的靶向识别序列、tracRNA序列和终止子的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述包含20个连续简并性碱基的长引物库的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述常规上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括SpCas9-NG。

8.一种根据权利要求1～7中任意一项所述的基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法的应用，其特征在于，所述应用包括在酿酒酵母全基因组定向进化以及迭代进化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

S1：SpCas9-NG表达载体质粒pCas9-NG的构建：以pTCL载体为模板，分别利用pCas9-NG-F1/pCas9-NG-R1和pCas9-NG-F2/pCas9-NG-R2两对引物扩增，使得突变后的Cas蛋白Cas9-NG识别NG序列，再通过Gibson组装将两个PCR片段环化成质粒pCas9-NG；

S2：PCR扩增得到gRNA表达框文库：以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，PCR扩增得到gRNA表达框文库；

S3：以pSCM质粒为模板，得到与所述gRNA表达框文库两端有50bp同源片段的pSCM线性化质粒；以及

S4：提供一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母，电转化步骤S1获得的质粒pCas9-NG进入酿酒酵母细胞得到菌株C0，再将各1μg PCR扩增的gRNA表达框文库和pSCM线性化质粒电转化进入菌株C0的感受态细胞，梯度稀释转化后的C0感受态细胞，并分别涂布于SD-Leu-Ura平板，挑选菌落，获得β-胡萝卜素生产能力显著提高的菌株。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用还包括以下步骤：

S5：针对步骤S4筛选获得的β-胡萝卜素生产能力显著提高的酿酒酵母菌株，涂布含有5’-氟尿嘧啶的SD-Leu平板，通过Ura3营养缺陷型标记与5’-氟尿嘧啶的不兼容性，去除表达随机gRNA的工具盒的pSCM质粒，对于去除表达随机gRNA的工具盒质粒的进化菌株，进行下一轮或多轮定向进化，直到得到高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株。