[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用在审

专利信息
申请号: 202110156691.4 申请日: 2021-02-04
公开(公告)号: CN112680450A 公开(公告)日: 2021-04-20
发明(设计)人: 王风清;赵明;魏东芝;高苗苗;陶欣艺;熊亮斌 申请(专利权)人: 华东理工大学
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
代理公司: 上海智信专利代理有限公司 31002 代理人: 余永莉
地址: 200237 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 crispr cas 系统 基因组 随机 突变 方法 及其 应用
【权利要求书】:

1.一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法,其特征在于,基于CRISPR-Cas系统,通过随机gRNA文库的引导,对生命体的全基因组进行散弹式随机切割,在非保真式DNA修补作用下,引发全基因组尺度上的随机突变。

2.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述随机gRNA文库是一种以gRNA通用表达框为模板,通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物,经PCR扩增获得的gRNA表达框文库,其中20个连续简并性碱基的区域对应于gRNA识别靶序列区域。

3.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述非保真式DNA修补是指不依赖于外源同源重组片段的宿主本身基因组修补机制。

4.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述gRNA表达框文库包括启动子、20个连续简并性碱基的靶向识别序列、tracRNA序列和终止子的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述包含20个连续简并性碱基的长引物库的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述常规上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法,其特征在于,所述CRISPR-Cas系统包括SpCas9-NG。

8.一种根据权利要求1~7中任意一项所述的基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法的应用,其特征在于,所述应用包括在酿酒酵母全基因组定向进化以及迭代进化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述应用包括以下步骤:

S1:SpCas9-NG表达载体质粒pCas9-NG的构建:以pTCL载体为模板,分别利用pCas9-NG-F1/pCas9-NG-R1和pCas9-NG-F2/pCas9-NG-R2两对引物扩增,使得突变后的Cas蛋白Cas9-NG识别NG序列,再通过Gibson组装将两个PCR片段环化成质粒pCas9-NG;

S2:PCR扩增得到gRNA表达框文库:以gRNA通用表达框为模板,通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物,PCR扩增得到gRNA表达框文库;

S3:以pSCM质粒为模板,得到与所述gRNA表达框文库两端有50bp同源片段的pSCM线性化质粒;以及

S4:提供一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母,电转化步骤S1获得的质粒pCas9-NG进入酿酒酵母细胞得到菌株C0,再将各1μg PCR扩增的gRNA表达框文库和pSCM线性化质粒电转化进入菌株C0的感受态细胞,梯度稀释转化后的C0感受态细胞,并分别涂布于SD-Leu-Ura平板,挑选菌落,获得β-胡萝卜素生产能力显著提高的菌株。

10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述应用还包括以下步骤:

S5:针对步骤S4筛选获得的β-胡萝卜素生产能力显著提高的酿酒酵母菌株,涂布含有5’-氟尿嘧啶的SD-Leu平板,通过Ura3营养缺陷型标记与5’-氟尿嘧啶的不兼容性,去除表达随机gRNA的工具盒的pSCM质粒,对于去除表达随机gRNA的工具盒质粒的进化菌株,进行下一轮或多轮定向进化,直到得到高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株。

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