[发明专利]一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用

说明书

本发明公开一种基于CRISPR‑Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用，所述全基因组随机突变方法基于CRISPR‑Cas系统，通过随机gRNA文库的引导，对生命体的全基因组进行散弹式随机切割，在非保真式DNA修补作用下，引发全基因组尺度上的随机突变。该全基因组随机突变方法可用于定向进化以及迭代进化，本发明以酿酒酵母生产β‑胡萝卜素为验证模型，在两个月内，完成了7轮迭代突变筛选，获得产量提高到10.5倍的进化菌株。组学分析表明平均每次操作可引入约122个突变，有50％左右基因的转录水平发生了显著的变化，说明经过突变进化，酵母代谢发生了深度重塑，实验证实本发明是一项简易可控的基因组变异新技术。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地涉及一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用。

背景技术

模拟自然进化，在实验室对生命体进行快速进化，是研究细胞复杂代谢性状、发展细胞新功能和实现生物育种的重要手段。实验室进化的思想由来已久，物理或化学“诱变”作为一种实验室进化的手段早在1920年代就已经出现，经过近百年的发展，形成了完备的技术和理论体系，积极推动了抗生素、有机酸、维生素、甾体制药、现代酿造、酶制剂、农作物育种等生物产业的快速发展。时至今日，诱变仍是许多企业和实验室育种的重要手段，在生物工业中发挥着举足轻重的作用。

然而，随着时代的发展，诱变技术的不足之处也日益突显，例如：①单一诱变手段所产生的变异类型较为单一，连续使用效果差，通常需要多种诱变技术复合使用；②操作危险，特别是化学诱变和辐照诱变，对操作人员有潜在的危害；③许多诱变方法需要特殊的设备、药剂或工作环境；④突变子稳定性差，易回复突变；⑤工作量大，周期长。然而不可否认的是，诱变是一种行之有效的实验室进化手段。鉴于此，若能克服上述问题，开发一种能够模拟复合诱变效果的新型基因组变异技术，将具有十分重要的科学意义和应用价值。

2000年以来，陆续出现了多重自动化基因组工程(MAGE)和基因组复制工程(GREACE)等几种较为典型的实验室进化技术。GREACE从破坏基因组复制的保真性入手，构建具有高频突变特性的细胞，使其能够自发、连续地发生基因组突变，但不足之处在于其变异类型单一，且突变子稳定性差，需要开发严谨的基因组复制调控系统，以防筛选后的菌株进一步发生高频突变。MAGE是一种依赖于基因组复制的变异技术，以人为设计合成的单链DNA寡核苷酸(30-110bp)为突变载体，通过在基因复制叉附近与基因组发生非保真性匹配，从而整合进入滞后链而导致基因组变异。对于错配修复能力较强的微生物，MAGE的使用效果不佳，需要对微生物的错配修复能力进行抑制；此外，其只能在基因组复制起点附近发挥作用，远离复制点的突变效率会快速下降，在20kb处只有约1％的突变率。上述技术在展现良好应用效果的同时，也显现出了明显缺陷。