[发明专利]烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法

说明书

本发明公开了烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。该酶促合成方法包括以下步骤：S1：以核糖‑5‑磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖‑5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，反应结束后可以直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。

技术领域

本申请涉及生物化工技术领域，尤其是涉及烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是烟酰胺核糖激酶与烟酰胺核糖等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。然而，NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，仅仅依赖于体内细胞的微量合成很难满足特定目标人群的需求。但随着对NMN的进一步研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。

随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前，NMN的体外制备方法，以化学合成为主，例如，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；而Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应；这些化学合成方法制备得到的产品中杂质过多，分离纯化极其困难，存在成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。因此，生物酶法制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。酶法生产NMN是一种绿色环保的生物催化方法，现有报道的酶法生产NMN的工艺中大多使用ATP作为反应原料，然而，一方面，ATP的价格昂贵导致原料成本过高，不利于酶法生产NMN的工业化；另一方面，酶促反应结束后，产物与原料的分离难度较高。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种分离纯化难度较低、成本低廉的烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。

本申请的第一方面，提供烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，该酶促合成方法包括以下步骤：

S1：以核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。

根据本申请实施例的酶促合成方法，至少具有如下有益效果：

申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖-5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，相比于AMP和ATP，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，可以在反应结束后直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。

其中，多聚磷酸盐是指由三个以上磷酸基团组成的无机盐或其混合物，其中至少部分或全部磷酸基团之间以磷酸酐键相连，多聚磷酸盐的非限制性实例包括低聚磷酸盐(如三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六偏磷酸盐)等，具体可以是多聚磷酸的碱金属盐，如钠盐、钾盐等。