[发明专利]一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法

权利要求书

1.一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：

步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料

菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP-1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；

步骤2：菌丝诱导实验

取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；

步骤3：转录组测序与数据分析

按说明书方法提取菌丝诱导前和诱导后的白色念珠菌的总RNA，将质检合格的总RNA样本（包含生物学重复）送至华大基因进行转录组测序（RNA-seq）分析，测序原始数据经过预处理后，得到白色念珠菌菌丝诱导前后各样本的有效转录组数据；

步骤4：细胞毒性分析

取过夜培养的白色念珠菌菌液，收集、洗涤、计数后备用；

步骤5：念珠菌感染宿主细胞的形态学观察

胰酶消化、收集并洗涤HUVEC、VK2/E6E7或PMA处理的THP-1细胞单层，用含1%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞数为2×10⁶/mL；

步骤6：逆转录和荧光定量PCR分析（qRT-PCR）

按照感染复数1（念珠菌:HUVEC细胞）或0.1（念珠菌:VK2/E6E7或THP-1细胞）建立1 h、2h、4 h和8 h感染模型，裂解处理宿主细胞后，4℃离心收集菌体，分别提取上述各时间点的念珠菌总RNA，按逆转录酶操作说明配制20 mL逆转录体系，于42℃反应60 min，70℃加热5min终止反应；

步骤7：统计学分析

所获得实验数据均以多次实验结果平均值±标准偏差表示。

2.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤1中悬浮生长状态的人单核细胞THP-1在实验前需经10 ng/ml 佛波酯（PMA）诱导分化48 h待贴壁培养后方可用于后续研究，主要仪器：生化培养箱、CO₂细胞培养箱、生物安全柜、恒温摇床、正置显微镜、倒置显微镜、多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、细胞计数仪、微量高速离心机、台式大容量离心机；其他主要试剂：RNA提取试剂盒、溶壁酶、逆转录酶、SYBR荧光定量PCR试剂、革兰氏染色试剂。

3.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤2中新鲜配制下列菌丝诱导液：①RPMI 1640细胞培养液；②FBS；③无菌水配制的10% FBS（v/v）；④含10% FBS的 RPMI 1640细胞培养液；⑤无菌水；⑥YPD液体培养基。用YPD调整菌数为5×10⁶/ml，取样镜检拍照，作为菌丝诱导前的对照，对应不同诱导条件，于37℃恒温培养箱内分别孵育1 h、2 h、3 h和4 h，每个时间点取菌液，于显微镜下观察菌丝形成情况，拍照记录，每种菌丝诱导体系的每个时间点各设置一个平行对照。

4.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤3中在RNA-seq在线数据分析平台通过样本属性、样本表达量、实验组间差异和基因注释等条件选择后，分析侵袭性酶类、菌丝形成、细胞黏附等念珠菌毒力基因在菌丝诱导前后的差异表达，差异倍数以log2表示，对log2³2的高可信度差异表达基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO），此外，根据差异基因GO结果进一步挖掘，用生物学功能注释的标准词汇表术语（GO term）筛选出与菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等与白色念珠菌毒力可能相关的新候选基因。