[发明专利]一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法

说明书

本发明公开了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括以下步骤：首先采用菌丝诱导实验获得以菌丝相生长的白色念珠菌，然后用转录组测序方法（RNA‑seq）分析菌丝诱导前后念珠菌转录组差异并筛选毒力相关基因，接着采用革兰氏染色方法和细胞增殖率检测分析经白色念珠菌感染后的不同宿主细胞各自的损伤情况；最后用逆转录‑荧光定量PCR方法（qRT‑PCR）分析念珠菌感染不同种类宿主细胞后毒力基因表达的差异。本方法可明确了菌丝形成与念珠菌某些毒力因子伴生关系，筛选出了在念珠菌感染不同细胞时出现差异性激活的潜在毒力相关基因，对阐明念珠菌感染宿主不同分子机制和筛选用于诊断的高特异性、高可信度念珠菌毒力基因提供了证据。

技术领域

本发明涉及白色念珠菌毒力相关基因的技术领域，具体为一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法。

背景技术

白色念珠菌（Candida albicans）是真菌中最常见的人类病原菌，是健康宿主皮肤、黏膜和消化道正常菌群的组成部分，然而，当免疫防御系统受损或正常菌群平衡被破坏时，其就会转化为机会性致病杀手，可引起浅表黏膜感染或全身性疾病，并导致较高死亡率，事实上，念珠菌的传播是导致艾滋病患者口咽疾病、女性外阴阴道炎症，以及糖尿病患者、早产儿和外科患者侵袭性真菌病的主要原因。这其中包括了白色念珠菌与上皮细胞直接接触破坏上皮细胞；血管内植入被污染的器材以及在外伤及外科手术处理时进入血液，趁机通过黏附和渗入血管内皮而进入深部脏器引起一些易感人群全身性感染；以及穿过血管进入组织中激活固有免疫细胞（如巨噬细胞）进而引起的一系列“遭遇战”，无论是念珠菌的浅表性感染还是系统性感染，在此过程中念珠菌与宿主细胞间的相互作用结果都将决定了感染的最终结局。白色念珠菌是一种形态双相型真菌，能够在各种环境下以各种可逆形态如酵母型（Y）、假菌丝型或菌丝型（H）生长，念珠菌由酵母向菌丝的转变（yeast-to-hyphae transition）能力已被证明对其致病性是必需的，除了从形态转变可作为一种毒力特性，念珠菌也可介导多种侵袭性酶入侵宿主组织以及逃避宿主抗真菌感染免疫，在白念珠菌的致病中起到关键作用。本研究拟对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索，所以我们提出了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以便于解决上述中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以解决上述背景技术中提出对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括

一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：

步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料

菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP-1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；

步骤2：菌丝诱导实验

取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；

步骤3：转录组测序与数据分析