[发明专利]一种表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌

说明书

本发明公开了一种表达D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。本发明通过从Dorea sp.CAG317和Clostridium cellulolyticum H10中获得D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，以枯草芽孢杆菌168作为底盘细胞，pMA5为表达载体构建重组枯草芽孢杆菌，实现该酶的表达。通过强组成型启动子筛选，成功将该重组菌在弱酸条件下催化效率提高至单酶重组菌株的12‑13倍，重组菌株B.subtilis 168/pMA5‑spovG‑DS‑srfA‑RC在30分钟内可产生244.3g/L的D‑阿洛酮糖，转化率为32.6％并消除了反应溶液褐变现象。

技术领域

本发明涉及一种表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖在C3位置的差向异构体，熔点为96℃，在水中具有较高的溶解度：25℃条件下每100g水中能溶解291g的D-阿洛酮糖，质量百分比为74％(w/w)，溶液密度达到1.35kg/L；50℃时溶解度进一步增大，每100g水中能溶解489g的D-阿洛酮糖，质量百分比为83％(w/w)。D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性单糖，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖的0.3％，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，同样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应可作为食品中蔗糖理想的替代品。毒理学实验证实，D-阿洛酮糖的半数致死量(LD₅₀)为16.3g/kg，相比果糖的LD₅₀为14.7g/kg，赤藻糖醇的LD₅₀为15.3g/kg，根据毒性评级，D-阿洛酮糖属于“相对无害”类别(毒性评级最低)。2014年，美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)正式批准D-阿洛酮糖为一般公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。

D-阿洛酮糖具有多种保健作用，可抗高血糖症，预防或治疗肥胖及因肥胖引起的炎症，有利地调节胆固醇代谢，通过调节肠道微生物群发挥其生物学效应。在最大剂量2000mg/kg时，D-阿洛酮糖对大鼠的生殖毒性无不良影响。D-阿洛酮糖属于自然界稀有糖，可通过化学法、微生物法合成。由于化学法对环境不友好，因此生物法合成D-阿洛酮糖以其绿色环保得到广泛的关注；而生物法一般是在D-阿洛酮糖3-差向异构酶或D-塔格糖3-差向异构酶的催化下制备D-阿洛酮糖，但是在制备过程中容易发生非酶促褐变，又被称为美拉德Maillard reaction反应。

美拉德反应可影响到很多食品的制造和储存，几乎可以发生在所有的食品上，包括糖和其它的碳水化合物的焦化作用，以及碳水化合物和蛋白质、氨基酸等经过加热处理或储存以后产生的美拉德反应，并且这两种化学反应都会产生褐色的东西。虽然有些食品是利用美拉德反应产生的颜色而特意制备的，但是在生物转化法制备D-阿洛酮糖时的美拉德反应，会消耗糖导致副产物生成并使产品颜色变黑，从而加重下游的纯化工艺负担。

并且，在现有技术当中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种在碱性条件下能够保持较高酶活的酶，其在弱酸条件下酶活力不足；发明人课题组在前期研究中，分别对来源于Dorea sp.CAG317的D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPEase和和来源于Clostridiumcellulolyticum H10 D-阿洛酮糖3-差向异构酶RCDPEase在不同pH条件下的酶活进行比较，结果如表1所示：

表1：不同的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在不同pH条件下的酶活