[发明专利]一种耐盐腺苷酸环化酶的基因、重组载体、重组菌及其应用

说明书

本发明公开一种耐盐腺苷酸环化酶的基因、重组载体、重组菌及其应用。所述的耐盐腺苷酸环化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的耐盐腺苷酸环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共334个氨基酸，理论分子量为35.99kDa。该重组菌所表达腺苷酸环化酶的催化活力随着氯化钠浓度的提高而增强，在氯化钠浓度为2.2 M时，重组菌细胞催化活力达到最大，最适底物浓度为30mM，最适pH为10.0，最适温度为40°C；利用该重组菌全细胞催化合成cAMP，产率达到96.6%。与现有报道的腺苷酸环化酶酶催化工艺或全细胞催化合成cAMP过程相比，该重组菌在高渗条件下具备更高的稳定性和催化效率，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一株表达耐盐腺苷酸环化酶的重组菌及其应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是一种广泛存在于动物、植物及微生物中的生理活性物质，作为生物体内的“第二信使”，对绝大多数酶促反应都有一定的调节作用，参与糖类代谢、脂肪代谢、核酸以及蛋白质合成等重要的生理活动。环磷酸腺苷在体内可以促进心肌细胞存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和抗缺氧能力，临床上主要用于心功能不全、心绞痛和心肌梗死等疾病的治疗，另外，其作为饲料添加剂广泛应用于畜禽产品的生产中，具有十分重要的应用价值。

目前cAMP大规模生产是以化学合成方式为主。除此之外，cAMP的制备方法还有发酵法和酶法等，发酵法面临重复性差、产量不稳定等问题，酶催化法存在酶含量低、酶稳定性差等问题。全细胞催化能避免酶的分离和提纯等操作，易于大规模生产，并且酶在天然的细胞环境中，可减少环境因素对酶的影响，有利于保持酶的稳定性，因此利用全细胞催化生产cAMP，是一条可行的途径且具有一定的优势。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐盐腺苷酸环化酶的基因、包含其的重组载体、重组菌及其应用。

为实现上述目的，本发明提供一种编码耐盐腺苷酸环化酶基因(Hacya)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因长度为1005bp，所述Hacya基因来自于Haloactinopolysporaalba(由NCBI数据库获得)。

本发明进一步提供所述基因编码的耐盐腺苷酸环化酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，共334个氨基酸，理论分子量为35.99kDa。

本发明还提供了包含所述的耐盐腺苷酸环化酶编码基因的重组载体。优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选出发载体为pET28a，所述耐盐腺苷酸环化酶基因插入pET28a的EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位点之间。

更进一步地，本发明提供了提供含所述重组载体的重组菌，优选地，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明还提供所述重组菌在制备环磷酸腺苷中的应用；包括以下步骤：

(1)构建重组菌，将活化的重组菌接种到LB培养基中，培养至OD600_nm为0.6-0.8时，加入IPTG，诱导表达4-15h，离心收集菌泥。

(2)全细胞催化：向Tris-HCl缓冲液中添加底物ATP、金属离子、氯化钠、表面活性剂和步骤(1)中得到的菌泥，建立全细胞催化反应体系，生成cAMP；或者将步骤(1)得到的菌泥进行超声破碎，离心，得到含耐盐腺苷酸环化酶的粗酶液，向Tris-HCl缓冲液中添加ATP、金属离子、氯化钠和粗酶液，建立酶催化反应体系，进行酶催化反应，生成cAMP。

其中，其中，重组菌的构建方法如下：

1)耐盐腺苷酸环化酶编码基因片段插入出发载体pET28a的EcoR I和Nde I酶切位点之间得到重组载体pET28a-Hacya；