[发明专利]一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种重组戊型肝炎口服纳米粒疫苗的制备方法和应用，所述疫苗抗原p146有良好的抗原性，在体内能够抵抗消化酶降解，在体外能够保持良好的热稳定性；所述p146的粘膜抗原递送系统是采用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒(CSNPs)，该纳米粒制备方便、成本较低且无毒性，能够有效保护抗原、促进肠粘膜对抗原的摄取。本发明公开纳米粒疫苗(CSNPs/p146)粒径均一、体系稳定、有良好的生物相容性，并能够刺激小鼠产生高水平的体液、粘膜免疫应答以及Th2型细胞免疫应答，适合用于重组戊型肝炎口服疫苗领域。

技术领域

本发明涉及重组蛋白口服疫苗技术领域，具体涉及一种将戊型肝炎重组衣壳蛋白制备成口服纳米颗粒疫苗的方法，以及该疫苗在预防戊型肝炎病毒感染中的应用。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性传染性疾病，在发展中国家持续构成严重威胁，每年至少有2000万 HEV感染病例，有症状的病例超过300万例，死亡人数约6万人。孕妇在妊娠晚期感染可导致高达30％的死亡率，免疫功能低下的患者感染后会慢性化。到目前为止，仍没有有效的、非致畸的针对HEV感染的特殊治疗方法，因此如何有效预防和控制HEV的传播成为一个重要的公共卫生问题。虽然现有的HE 疫苗对健康成人具有很好的保护作用，但注射类疫苗由于不良反应较多而不利于推广。相比之下，重组HE口服疫苗的研制成本较低、免疫方式简单且安全性更高，并能够刺激肠粘膜产生有中和病毒能力的分泌型IgA(sIgA)，在一定程度上可弥补注射疫苗的不足。

然而，由于直接口服蛋白类抗原产生的抗原特异性免疫反应有限，该类抗原在口服疫苗应用中仍然面临着巨大挑战。采用能够负载蛋白类抗原的纳米材料作为抗原递送系统在一定程度上可以解决上述问题。壳聚糖纳米颗粒目前已经作为一种有效的纳米载体在一系列动物模型中进行了诸多实验，并已被证明可以促进实验动物产生有效的免疫反应。迄今为止，并未有任何报道涉及壳聚糖纳米颗粒封装戊型肝炎重组衣壳蛋白在口服疫苗方面的应用前景。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法，进而克服现有技术缺陷，提高戊型肝炎重组衣壳蛋白的口服生物利用度，提高口服免疫原性。

技术方案：为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

为了实现上述目的，本发明对口服戊型肝炎重组疫苗抗原p146进行体内消化酶耐受实验和热稳定性实验。

为了提高p146的生物利用度及免疫原性，本发明公开了一种负载重组蛋白 p146的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将p146水溶液与三聚磷酸钠溶液按照1:1的体积比例充分混合，得到p146-三聚磷酸钠混合液；

(2)将p146-三聚磷酸钠混合液逐滴加入壳聚糖冰醋酸溶液中，以3ml/min 的速度进行磁力搅拌，从而得到表面带正电荷的纳米颗粒。

优化地，所述p146-三聚磷酸钠混合液与壳聚糖冰醋酸溶液的体积比为2:1。

优化地，所述p146-三聚磷酸钠混合液中，p146浓度为0.25-1mg/ml(优选 1mg/ml)，三聚磷酸钠的浓度为0.5-2mg/ml(优选1mg/ml)。

优化地，所述壳聚糖冰醋酸溶液中壳聚糖浓度为0.5-2mg/ml(优选2mg/ml)

优化地，所述纳米颗粒制备体系的pH值为5.5-7.0(优选6.0)。

优选地，所述壳聚糖壳聚糖脱乙酰度≧95％，粘度为100-200mpa.s，所述负载p146的壳聚糖纳米颗粒的粒径为376.0±109.4nm，PDI为0.397±0.02，zeta电位为18.0±1.2mv，包封率为65.0±5.0％，载药量为67.5±7.5％。

技术效果：