[发明专利]一种鉴定拟无枝酸菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种鉴定拟无枝酸菌的检测方法，属于分子生物学领域。本发明提供了一种能够特异性鉴定拟无枝酸菌的引物对，该引物对是基于拟无枝酸菌中的一个特有保守基因AMETH_3452及其拟无枝酸菌属中同源基因片段设计的，特异性强；本发明通过PCR参数的优化，建立了快速检测拟无枝酸菌的PCR方法，多次重复证明，该方法快速，灵敏，并可实现同一时间检测若干个菌株，检测成本低、耗时短，且效果好。为下一步作为检测环境、动物或临床上的放线菌研究提供依据。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测拟无枝酸菌属的引物对及检测方法。

背景技术

微生物产生的次级代谢产物具有各种不同的生物活性，是目前药物发现的重要宝库。微生物药物具有来源丰富、微生物所产生的大多数次级代谢产物化学结构独特，难以合成的特点，因此，从微生物丰富多样的次级代谢产物中挖掘新的具有药用价值的化合物分子，开发原创药物，具有重要的临床应用价值。

拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)是一类重要的抗生素产生放线菌，如万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)和利福霉素产生菌地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)。大部分的拟无枝酸菌属菌株是从土壤中分离，部分从海洋、沙漠、沉积物、临床样本等分离，归属于放线菌纲、假诺卡氏菌目、假诺卡氏菌科。该属菌种分为2个主要分支，东方拟无枝酸菌分支(Amycolatopsis orientalis subclade，AOS)和甲基拟无枝酸菌分支(Amycolatopsis methanolica subclade，AMS)。其中，AOS里的菌株常被发现可以生产抗生素，例如东方拟无枝酸菌、地中海拟无枝酸菌。AMS的代表菌株A.methanolica是一个兼性甲基营养放线菌，未发现产生抗生素，且次级代谢物较少。AMS中的菌种能够在45℃以上的条件下生长，属于嗜热放线菌。

目前，鉴定拟无枝酸菌属的方法主要是通过基因测序，比对16S rDNA，具体方法如下：先提取基因组DNA，然后PCR扩增16S rDNA片段，对16S rDNA片段测序后，再进行序列比对，一般序列相似度在99％以上则认为是同一种细菌。16S rDNA/RNA基因序列广泛应用于细菌鉴定或构建细菌的系统进化关系，另外，还可以gyrB、recN基因作为系统发育鉴定标记有效区分菌种。但是上述方法虽然可以鉴别出拟无枝酸属，但成本高，耗时长。

目前没有针对拟无枝酸菌属进行特异性扩增的引物，缺少快速检测的方法，不利于大样本量的菌种鉴定。因此，亟需开发一种能够快速鉴别拟无枝酸菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够特异性扩增拟无枝酸菌(Amycolatopsis)特有基因序列的引物对，通过PCR扩增反应可以直接快速地鉴别出拟无枝酸菌。

为实现上述目的，本发明将拟无枝酸菌属中完整基因组进行序列比对，发现拟无枝酸菌中存在一个保守基因序列，对应已知拟无枝酸菌Amycolatopsis methanolica 239全基因组中的AMETH_3452，该基因位于拟无枝酸菌属中的环形基因组中间位置，且在拟无枝酸菌中不同菌株之间序列同源性较高。基于这一发现，本发明设计能够特异性扩增出AMETH_3452基因及其拟无枝酸菌属中同源基因片段的引物对，通过是否能扩增出目标产物即可判断待测菌株是否属于拟无枝酸菌属。

核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的AMETH_3452基因及其同源基因片段作为标靶在鉴定拟无枝酸菌(Amycolatopsis)中的应用。

通过序列分析在该基因的300bp～600bp之间保守性较高，因此在此区域设计兼并引物，通过PCR方法能够有效地将该属鉴定出来。