[发明专利]一种核壳纳米多聚物的制备方法及其在辅酶循环再生上的应用

说明书

本发明公开了一种核壳纳米多聚物的制备方法及其在辅酶循环再生上的应用，通过金属骨架化合物ZIF材料原位共固定辅酶聚合物和两种辅酶依赖性酶制备核壳结构的多聚物。本发明利用ZIF外壳限定多酶生物催化反应区域，利用双酶分别在引发剂和底物的作用下，实现辅酶的循环再生和双酶级联反应的进行。在核壳多聚物使用期间不需要再添加额外的辅酶，在5次重复使用后对底物的转化率与初始转化率的比值仍有70‑80%。核壳纳米多聚物在有辅酶参与的生物合成与转化上具有十分广阔的前景。

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，还涉及多酶共固定化和辅酶循环再生领域。

背景技术

氧化还原酶广泛应用于催化制备手性醇,羟基酸,氨基酸等方面。大多数的氧化还原酶催化反应都需要辅酶,在其所需辅酶中,NAD(P)⁺-NAD(P)H体系占90％左右。但这些辅酶价格昂贵,限制了氧化还原酶的应用。酶在受限结构中的空间组织为设计生物催化级联提供了一种通用方法，将一种酶的产物作为另一种酶的底物，从而实现多酶之间的相互通讯，利用这一原理可以利用在纳米尺度下实现多酶催化级联和辅酶的循环再生。

目前多酶在微尺度或纳米尺度等不同空间组织下的共固定化已经被报道，酶在DNA 支架上的空间定位，如DNA带、DNA链或DNA折叠，已被用于操作两或三酶级联。因此，对于多酶催化级联以及固定化多酶的可行性策略的研究在酶均相/非均相催化中具有重要作用。但是这种载体存在价格昂贵，操作复杂等问题限制其在实际应用中的发展。

目前关于单酶的封装和固定化的研究集中在提高封装酶的稳定性和催化活性上，并在催化代谢过程中的氧化还原反应和对底物的转化效率方面有了较深入的研究。关于多酶的共固定化以及联动体系的构建等仍需要进行大量的研究。多酶共固定化的局限性之一是无法正确地折叠大的多结构域蛋白，因此效率通常较低。尤其是多酶在固定化时或封装的同时往往会因为溶剂的作用而使活性位点损失，而合成金属骨架化合物纳米颗粒时的溶剂热、高温高压、超声辅助等条件对酶的活性位点影响较大。

以下是主要相关的文章和已经公开的专利，但明显与本申请文件不同，如表1：

表1 部分公开文章或专利与申请文件的区别

发明内容

本发明提供了一种用于核壳纳米聚合物的制备方法以及其在辅酶循环再生上的应用。本发明通过采用原位的方法利用材料的生长将不同尺寸的多种酶共固定化，利用多酶的反应催化过程中对不同状态下辅酶的转化实现辅酶的循环再生。

本发明所涉及的所有试剂均购买于试剂公司，如辅酶依赖性酶、辅酶、乙酸锌、硝酸锌、2-甲基咪唑、三乙胺、乙酸钴等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种核壳纳米多聚物的制备方法，主要利用ZIF-8和ZIF-67晶体的生长特性，将两种辅酶依赖性酶、辅酶多聚物原位共固定化而得。

进一步，所述的制备方法的步骤中，在固定化辅酶时，将介孔硅表面进行羧基修饰后与辅酶的非活性位点结合实现辅酶的固定。

进一步，固定到同一核壳纳米体系中的两个辅酶依赖性酶分别为能够催化转化两种不同状态辅酶，即两个酶能分别进行脱氢和加氢从而实现辅酶的循环再生。当辅酶聚合物固定化辅酶为NAD⁺和NADH这一组合中的一种时，可将辅酶依赖性酶划分为乙醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶、酵母酒精脱氢酶等两类酶。多聚物中固定的两种酶可分别选用这两类的某一个组合。辅酶聚合物固定化辅酶为NADPH和NADP⁺这一组合中的一种时，也可将辅酶依赖性酶划分为两类，一类为苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、异丙醇脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。另一类为谷氨酸脱氢酶，多聚物中固定的两种酶从第一类任选一种与谷氨酸脱氢酶组合。

进一步，两种辅酶依赖性酶与辅酶聚合物的质量比为1:2-1:10。