[发明专利]基于高通量测序寄生虱线粒体基因组组装的方法和应用

说明书

本发明为基于高通量测序寄生虱线粒体基因组组装的方法和应用，属于生物信息学技术领域，使用两对引物对寄生虱的全基因组DNA进行扩增和测序，得cox1和rrnS基因部分保守序列；再对全基因组DNA测定浓度后构建成对末端基因组DNA文库，高通量测序，处理后产生了2GB数据；根据cox1和rrnS基因部分保守序列对2GB数据进行重新组装重叠群，直至重叠群的两端重叠后进行多重序列比对，鉴定出保守的非编码区序列并将其作为比对Illumina序列数据集的参考，直至寄生虱线粒体组被全部组装。本方案操作简便，成本低速度快，准确性高，组装后的线粒体基因组通过BLAST进行校准，长片段PCR法进行验证，解决了寄生虱线粒体基因组的组装与注释的难题。

技术领域

本发明属于生物信息学技术领域，具体涉及基于高通量测序寄生虱线粒体基因组组装方法和应用。

背景技术

传统线粒体基因组测序技术主要是基于PCR扩增产物的Sanger测序方法，针对已知线粒体基因的突变位点设计引物，进行PCR扩增直接测序。其中通过长PCR产物结合引物步移法(primer walking)是目前小规模线粒体基因组测序的常用方法。

线粒体对于大多数真核细胞和生物的生存至关重要。由于这一重要功能，线粒体基因组在深度进化范围内具有非常稳定的结构。因此，线粒体基因组已成为使用频率最高的分子标记之一，被广泛应用于进化、系统发育、种群遗传结构、生物地理学及物种分类鉴定等领域的研究。虱目的线粒体基因组存在高度的重排和裂化，使虱子的线粒体组学研究提高了难度。不利于虱子分子系统学，种群遗传学的研究。

寄生虱线粒体基因组裂化是指，线粒体基因组由一个完整的大环裂化为若干个小环。我们在以前的研究中观察到，每个mt微小染色体都有一个不同的编码区，但有一个保守的非编码区。

昆虫的传统线粒体基因组测序技术主要是基于PCR扩增产物的Sanger测序方法，其中通过长PCR产物结合引物步移法(primer walking)是目前小规模线粒体基因组测序的常用方法。但由于虱目缺乏通用引物信息，使得扩增线粒体基因组部分片段变得困难。而其线粒体基因组中特殊的结构，如重复序列、高A+T含量和二级结构也会导致扩增的失败。后随着生物技术的发展，测序成本不断降低以及高通量技术的发展，高通量技术也被广泛应用于虱目的线粒体基因组全序列研究。但是，由于虱目的线粒体基因组的高度重排和裂化，其线粒体的组装和注释成了新的技术难点。

发明内容

本发明的目的在，基于高通量法的情况下，提供一种解决虱目线粒体基因组因重排和分裂而难以组装和应用的方法，以解决上述背景技术中虱目的线粒体组装和注释难度大的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供技术方案包括以下六个步骤：

(1)根据DNasy组织试剂盒(Promega，Madison，USA)说明书，从待测寄生虱中提取全基因组DNA。

(2)利用引物对cox1和rrnS基因的扩增和测序。双向测序后分别得到一对正链和负链，将相对应的正链与负链的反向互补链进行对比，得到一段完全重合的序列，此序列即为cox1和rrnS相对保守的序列。

(3)使用Qubit荧光计测定DNA浓度。

(4)用MiSeq/HiSeq PE300(Illumina，San Diego，CA，USA)构建成对末端基因组DNA文库(350bp插入)，用于高通量测序，收集的原始读数以FASTQ格式输出。通过删除适配器读取、冗余读取和富含‘N’的读取来过滤原始读取；最后，对此寄生虱产生了2GB cleandata(256bp的对端读取)。

(5)根据cox1和rrnS相对保守的序列，使用Geneious 11.1.5从Illumina序列读数中重新组装重叠群；组装参数为：最小重叠识别率99％，最小重叠150bp。运算至重叠群的两端重叠，表示线粒体基因组排列最终呈一个环形。